| Project/Area Number |
06857021
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Research Field |
Bacteriology (including Mycology)
|
|---|
| Research Institution | Sapporo Medical University |
|---|
Principal Investigator |
木村 浩一 札幌医科大学, 医学部, 助手 (90177915)
|
|---|
| Project Period (FY) |
1994
|
| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1994)
|
| Budget Amount *help |
¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 1994: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
|
|---|
| Keywords | gene targeting / gene therapy / RecA |
|---|
| Research Abstract |
平成5年度の科学研究費では、遺伝子組み替えに関与するRecA(大腸菌由来)とSV40 large T antigenのmnclear location signal を融合させた合成酵素(RecA-T)遺伝子を作製し、この合成酵素が、大腸菌内で本来の活性を保持していることを確認後、大量精製した。この時点で得られたRecA-Tのin vitroでの活性が低かったため、平成6年度の科学研究費では、高活性の合成酵素を得るために、RecA-Tの精製過程と、使用する発現ベクターの種類に関して検討を行った。精製方法に関しては、大腸菌破壊に使用する界面活性剤、温度、バッファーについて比較検討したが、精製後の活性には殆ど差が認められなかった。このため、発現ベクターをpMAL-c2から、pGEXに変更し、種々の精製方法で検討を行ったが、やはり高活性のRecA-Tを得ることが出来なかった。pMAL-c2およびpGEXは、いずれも目的蛋白がプラスミド由来の蛋白との融合蛋白として産生されるため、Factor XaもしくはThrombinによる分解操作が必要である。この操作は低温では行えないため、RecA-Tの活性に影響を与える恐れがあり、分解操作を必要としない発現ベクターでRecA-Tを産生させることにした。この目的のため、pQEというベクターを使用することにした。このベクターは、目的蛋白のN端もしくはC端に6個のヒスチジンが付加されるように設計されており、精製の際には、6個のヒスチジンと高親和性を持つNi-NTA resinを使用した。一般的に、6個程度のヒスチジンが付加されても酵素活性に影響が無いとされており、この方法で精製した酵素は、付加しているヒスチジンを除去する必要が無いのが利点である。現時点では、RecA-Tの構造遺伝子をpQE-32に組み込み、大腸菌内での活性を確認しており、今後大量精製してin vitroでの活性を測定する予定である。
|
