微生物由来の新規な糖質酸化酵素の探索と有用ウロン酸生産への応用

• Project/Area Number: 06J00529
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Applied biochemistry
• Research Institution: Waseda University
• Principal Investigator: 高橋 周相 Waseda University, 理工学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2006 – 2008
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2008)
• Budget Amount: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000); Fiscal Year 2008: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2007: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2006: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: ウロン酸 / 酸化還元酵素 / 微生物 / 酸化酵素

Research Abstract

新規な糖質酸化酵素を生産する微生物を探索しウロン酸生産に利用することを目的として、新たな微生物のスクリーニング方法の検討および分析方法について検討した。微生物のスクリーニング方法に関しては、まず選択培地の組成についての検討を行った。モデル反応としてはD-グルコンスをその酸化物であるD-グルクロン酸へ酸化反応により変換するという反応であるが、多くの微生物はD-グルコースを資化するものが多く、微生物の選択培地においてD-グルコースを用いることは不適当である。そこで、構造の類似性に着目し、糖質酸化活性が強ければD-グルコースに代替できると予想される、テトラヒドロピラン-2-メタノール(THPM)、D-グルカール、2-デオキシ-D-グルコース(DG)を用いることを考案した。対照実験としてTHPM、D-グルカールおよびDGが細菌の生育に与える影響について検討し、添加量をそれぞれ0.5〜1.0g/lと決定した。以上の検討をもとに、THPM、D-グルカール、DGを炭素源に用いた最少培地を利用することで、目的の酵素を生産すると思われる微生物の探索を行った。また、D-グルコースおよびD-グルクロン酸を同時に検出できる方法について検討し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた両化合物の同時定量分析のための条件を確立した。実際に選択培地とHLPC分析条件を使用して、土壌約200サンプルの生理食塩水懸濁液を培地に接種したスクリーニング(集積培養)を行い、選択培地で生育可能な微生物の集積培養系を数種類取得した。得られた候補微生物の糖質酸化活性を確認したところ、Serratia属細菌(またはYersinia属細菌)の近縁種を含む2種類の集積培養系について、反応後の溶液にHPLC分析でD-グルクロン酸と同じ保持時間に化合物を検出した。得られた化合物の詳細について標準添加法によって分析したところ、得られた化合物は2-ケトグルコン酸と推定された。