アミノアシル-tRNA合成酵素によるtRNAの分子認識

Research Project

Project/Area Number	07250219
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Institute of Space and Astronautical Science
Principal Investigator	長谷川典巳宇宙科学研究所, 惑星研究系, 助教授 (60095023)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	朝原治一宇宙科学研究所, 惑星研究系, 助手 (90270438)
Project Period (FY)	1995
Project Status	Completed (Fiscal Year 1995)
Budget Amount *help	¥2,700,000 (Direct Cost: ¥2,700,000) Fiscal Year 1995: ¥2,700,000 (Direct Cost: ¥2,700,000)
Keywords	tRNA^<Pro> / tRNA^<Leu> / アミノアシル-tRNA合成酵素 / 大腸菌 / アイデンティティー / アミノアシル化 / in vitro転写反応 / SELEX
Research Abstract	tRNAのアミノアシル-tRNA合成酵素による分子認識を研究するための対象として、プロリンtRNAを選び、まず初めに大腸菌では唯一RNAレベルで一次構造が明らかにされていない3種のプロリンtRNAのうち、メジャーなプロリンtRNA_1(アンチコドン、CGG)をビチオン化DNAプローブを用いて単離し、修飾を含めてその一次構造の決定を行った。またT7RNAポリメラーゼの系で、in vitroでの構造変異体を数多く作製し、アミノアシル化反応により各変異体の反応速度論的定数を測定した結果、大腸菌のプロリンtRNAのプロリル-tRNA合成酵素による認識部位として、アンチコドン2文字目と3文字目のG35G36、アンチコドンに隣接するG37、識別位塩基A73、TΨステム中のG49、アクセプターステムのC1-G72(特にG72)、それにジヒドロアーム中のU17Aを同定した。また、SELEXによるロイシンtRNAの構造と活性と特異性の相関については、Dループ及びエキストラループにランダムな塩基を導入したDNAを合成し、M-MLV逆転写酵素で二本鎖DNAとし、T7RNAポリメラーゼにより未修飾tRNAプールを作製し、アミノアシル化後、活性なRNAを選別し、逆転写酵素でcDNAを調製して、これをPCRで増幅過程を繰り返すことによって、アミノ酸特異的でより活性の高いtRNAを選別することができた。現在、これらの高い活性を持ったtRNA遺伝子の構造を決定しつつある。