| Project/Area Number |
07259218
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
池原 征夫 福岡大学, 医学部, 教授 (70037612)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高見 昇 福岡大学, 医学部, 助手 (80154904)
三角 佳生 福岡大学, 医学部, 助教授 (10148877)
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| Project Period (FY) |
1995
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1995)
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| Budget Amount *help |
¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 1995: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
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| Keywords | GPIアンカー型蛋白質 / 糖脂質(GPI)転移酵素 / in vitro アッセイ / GPIシグナルペプチド / アフィニテイーリガンド / キメラ蛋白質 |
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| Research Abstract |
まずGPI転移酵素活性を検出するための比較的簡便なAssay系を確立した。ドナー基質として、胎盤型アルカリホスファターゼ(PLAP)のC末端シグナルペプチドをα2u-グロブリンのC末端につけたキメラ蛋白質(αGL-PLAP)を調製した。実際には、in vitro transcriptionで得たRNAを、酵素を含むミクロソーム存在下に無細胞蛋白合成系(^<35>S-メチオニン存在下)で翻訳させた。反応産物をSDS-PAGE/フルオログラフィーで解析すると、未反応基質(αGL-PLAP)は25kDa分子種として、一方、GPIアンカー型に変換された反応産物は22kDa分子種として検出された。その量比からGPI転移酵素活性を算出することができることがわかった。
一方、C末端シグナルペプチドの切断部位のアミノ酸(Asp)をTrpに置換した基質(αGL-PLAP/DW)を用いると、シグナルペプチドの切断は起こらず25kDa分子種しか得られないこと、また、この基質は切断型基質に対して競合阻害をかけることがわかった。そこで、この非切断型基質が本酵素に対するAffinity ligandになるうるか否かを検討した。αGL-PLAP/DWを発現させた細胞を^<35>S-メチオニン存在下に培養した後Cell lysatesを調製し、架橋剤DSPで処理した。このように調製したサンプルから、抗αGL抗体に反応する免疫沈降物を得た。沈降物を還元しSDS-PAGE/フルオログラフィーで解析すると、基質(αGL-PLAP/DW)以外に分子量45kDaと75kDaの2種類の蛋白質が得られた。クロスリンク処理をしない場合、この2種類の蛋白質は得られないことから、両蛋白質は基質と何らかの相互作用をしている因子と考えられる。現在、両蛋白質のGPI転移酵素との関係について解析を進めている。
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