糖脂質(GPI)転移酵素の同定と遺伝子クローニング

Research Project

Project/Area Number	07259218
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Fukuoka University
Principal Investigator	池原征夫福岡大学, 医学部, 教授 (70037612)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	高見昇福岡大学, 医学部, 助手 (80154904) 三角佳生福岡大学, 医学部, 助教授 (10148877)
Project Period (FY)	1995
Project Status	Completed (Fiscal Year 1995)
Budget Amount *help	¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000) Fiscal Year 1995: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Keywords	GPIアンカー型蛋白質 / 糖脂質(GPI)転移酵素 / in vitro アッセイ / GPIシグナルペプチド / アフィニテイーリガンド / キメラ蛋白質
Research Abstract	まずGPI転移酵素活性を検出するための比較的簡便なAssay系を確立した。ドナー基質として、胎盤型アルカリホスファターゼ(PLAP)のC末端シグナルペプチドをα2u-グロブリンのC末端につけたキメラ蛋白質(αGL-PLAP)を調製した。実際には、in vitro transcriptionで得たRNAを、酵素を含むミクロソーム存在下に無細胞蛋白合成系(^<35>S-メチオニン存在下)で翻訳させた。反応産物をSDS-PAGE/フルオログラフィーで解析すると、未反応基質(αGL-PLAP)は25kDa分子種として、一方、GPIアンカー型に変換された反応産物は22kDa分子種として検出された。その量比からGPI転移酵素活性を算出することができることがわかった。一方、C末端シグナルペプチドの切断部位のアミノ酸(Asp)をTrpに置換した基質(αGL-PLAP/DW)を用いると、シグナルペプチドの切断は起こらず25kDa分子種しか得られないこと、また、この基質は切断型基質に対して競合阻害をかけることがわかった。そこで、この非切断型基質が本酵素に対するAffinity ligandになるうるか否かを検討した。αGL-PLAP/DWを発現させた細胞を^<35>S-メチオニン存在下に培養した後Cell lysatesを調製し、架橋剤DSPで処理した。このように調製したサンプルから、抗αGL抗体に反応する免疫沈降物を得た。沈降物を還元しSDS-PAGE/フルオログラフィーで解析すると、基質(αGL-PLAP/DW)以外に分子量45kDaと75kDaの2種類の蛋白質が得られた。クロスリンク処理をしない場合、この2種類の蛋白質は得られないことから、両蛋白質は基質と何らかの相互作用をしている因子と考えられる。現在、両蛋白質のGPI転移酵素との関係について解析を進めている。