脳由来の新神経細胞生存維持因子の単離

• Project/Area Number: 07264244
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Tokyo Institute of Psychiatry
• Principal Investigator: 森 啓 財団法人東京都精神医学総合研究所, 分子生物学研究部門, 研究員 (10159189)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐原 成彦 東京都精神医学総合研究所, 技術部, 研究員 (40261185) ; 宇佐美 美穂子 東京都精神医学総合研究所, 技術部, 研究員 (10261182)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000); Fiscal Year 1995: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: 神経変性死 / 栄養因子 / 培養

Research Abstract

胎生18日齢のラット大脳皮質神経細胞の初代培養を用いた.細胞密度は24-well培養皿に低密度(0.8×105/cm2)で播種した.これに細胞播種と同時にウシ脳ホモジェネート調製液を加え,4日間培養後にMTTキットにて生存細胞を定量し,コントロールと比較した.ウシ脳ホモジェネートの調製はPBSにプロテアーゼ阻害剤を加えたものを用い,ブレンダーで懸濁し,10万g遠心上清を得た.この上清の30-50%硫安画分沈殿を50mMTris-HCl pH7.6に溶解し,脱塩後に50mMTris-HCl pH7.6で平衡化したDEAE sephacel に吸着させ,0-0.12M NaClの分画を抽出した.この抽出液を硫安で濃縮した後,ケ-ル濾過 Sephacryl S-100HR(φ2.5×100cm)にて分取したサンプルから分子量別に4つの生物活性ピーク(A,B,C,D)を得た.40K付近の peak A を集め,脱塩後に10mMリン酸バッファーにて平衡化したResouce Q に吸着させ,0-0.3M NaClの linea gradient にて抽出した.Resouce Qの0-0.3M NaCl linea gradient にて活性が3peakに分かれた.各フラクションの抗NSE抗体(Enzo Biochem)と抗CPB-1(=AnnexinV)抗体(Kowa)によるWestern blottingの結果,NSE(neuron specific enorase)やCPB-1による活性peak以外に 0.08-0.1M NaCl付近に新しい活性中心を発見した.硫安を加え1.2M硫安サンプルとし,疎水性カラムphenyl superoseに吸着させ,1.2-OM硫安の linear gradient で抽出し,ゲル濾過 superdex 75(φ10×300mm)を行った.新しい活性は phenyl superose にて0.7-0.5M硫安分画みられ,次の superdex 75 のゲル濾過にて約30K付近に来ることが判った.SDS-PAGEの銀染色にて候補の活性物質は約22Kと約29Kと考えられた.現在,ウシ脳約4KgのLarge scaleで精製し,蛋白の同定中である.

Research Products

• [Publications] Mori, H. et al.: "Tau in cerebrospinal fluids : Establishment of the sandwich ELISA with antibody specific to repeat-sequence in tau" 186. 181-183 (1995)
• [Publications] Tamaoka, A. et al.: "Ubiquitinated αB-crystallin in glial cytoplasmic inclusions from the brain of a patient with multiple system atrophy" J. Neurol. Sci.129. 192-198 (1995)
• [Publications] Tamaoka, A. et al.: "Amyloid β protein 1-42/43(Aβ1-42/43)in cerebellar diffuse plaques : enzyme-linked immunosorbent assay and immunocytochemical study" Brain Res.679. 151-156 (1995)
• [Publications] Gearing, M. et al.: "Regional variation in the distribution of apolipoprotein E and Aβ in Alzheimer's disease" J, Neuropathol. Exp. Neurol.54. 833-841 (1995)
• [Publications] Harigaya, Y. et al.: "Modified amyloid β protein ending at 42 and 40 with different solubility accumulates in the brain of Alzheimer's disease" Biochem. Buophys. Res. Commun.211. 1015-1022 (1995)
• [Publications] Tamaoka, A. et al.: "Antibodies to amyloid β protein(Aβ) crossreact with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)" Neurobiol. of Aging. (印刷中). (1996)