| Project/Area Number |
07274269
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
伊藤 恭悟 久留米大学, 医学部, 教授 (50125499)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今井 康久 久留米大学, 医学部, 助手 (90268847)
中尾 真修 久留米大学, 医学部, 助手 (40258447)
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| Project Period (FY) |
1995
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1995)
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| Budget Amount *help |
¥4,000,000 (Direct Cost: ¥4,000,000)
Fiscal Year 1995: ¥4,000,000 (Direct Cost: ¥4,000,000)
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| Keywords | 癌退縮抗原 / 遺伝子クローニング / 扁平上皮癌 / HLA-A2601拘束性 / キラーT細胞 / 抗原ペプチド |
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| Research Abstract |
HLA-A2601拘束性扁平上皮癌特異的癌退縮抗原遺伝子と考えられるcDNA (6A1と仮称)を以下の方法を用いてクローニングした。
1)一次スクリーニング: HLA-A2601 gene及びcDNAライブラリーのVA13 cellsへのdouble transfection及びCTLとIFNγELISAによるスクリーニング。リポフェクチン法にてHLA-A2601 geneとKE4癌細胞株cDNAライブラリーをVA13 cellにdouble transfectした。HLA-A2601拘束性CTL (10000 cells/well/200μl)を加えてさらに18時間培養し、上清中のIFNγ値をELISAにて測定した。
2)二次スクリーニング:一次スクリーニングにて陽性であった4 wellsからのcDNAライブラリーをさらに二次スクリーニングに提供し、合計800個(4×200)のコロニーよりプラスミドDNAを作成しHLA-A2601とともにVA13 cellsにdouble transfectionし1)同様の操作にて約20個の陽性クローンを得た。
3)三次スクリーニング:二次スクリーニングにて陽性であった20個のクローンを再度検定し2個のクローン(6A1と14G1)をえた。これらの遺伝子をSP6及びT7プライマーを用いて搬入遺伝子の塩基配列を自動塩基配列解析装置(pharmacia社)を用いて決定した。
4) 6A1は1.2kb, 14G1は3.2kbのこれまでに報告されてない塩基配列であった。両クローンを再度検定し、活性のより明確な6A1を先発して研究を推進させつつある。即ちdeletion mutantを作成しHLA-A2601結合性癌抗原ペプチド及びNortherh Blot法にて組織分布を実施中である。以上要約すると6A1遺伝子は約1.2kbより成り膜貫通部分と思われる構造を有し、Gene Bankでの検索では新規のものと考えられる。
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