モノクローナル抗体を用いたヒラメの免疫グロブリンの産生機構の解析

• Project/Area Number: 07660246
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: General fisheries
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 楠田 理一 高知大学, 農学部, 教授 (90036715)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 1995: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
• Keywords: モノクローナル抗体 / ヒラメ / 免疫グロブリン / Edwardsiella tarda / ポリクローナル抗体

Research Abstract

ヒラメの免疫は、100mg/mlに調製したEdwardsiella tarda ホルマリン死菌(FKC)をフロイントの完全アジュバンドと等量混合したのちに、1尾あたり1mlを腹腔内注射して行った。採血は免疫5週間後に行い、血清は4℃で一晩静置した血液を10000RPMで5分間の遠心分離を行って回収した。回収した血清は、45%飽和硫酸アンモニウム塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過を行って免疫グロブリン(Ig)を精製した。精製したIgの純度は90%以上であった。ヒラメIgの分子量は、Native-PAGEの結果、690kDaであった。また、H鎖およびL鎖の分子量は、10%SDS-PAGEの結果、それぞれ72kDaおよび21kDaであった。精製ヒラメIgに対するマウスモノクローナル抗体を常法により作製した結果、19種のモノクローナル抗体が作製された。作製したモノクローナル抗体のキャラクタリゼーションを行った結果、6株がヒラメIgのH鎖を認識し、5株がL鎖を認識することが明らかになった。
精製ヒラメIgに対するウサギポリクローナル抗体を常法により作製し、ELISA法によるヒラメ血清中のIg量の測定方法を検討した結果、ナノグラム単位での測定が可能であった。また、体重100gあたり10mgのE.tarda FKCを腹腔内注射して免疫したヒラメの血清中のIg量を経時的に測定した結果、免疫2週間後から徐々に増加し、4週間後にピークに達した。そして、7週間後までは高い値を維持した。また、E.tardaに感染したヒラメ病魚の血清からも、特異抗体を検出することができた。
ポリクローナル抗体を用いた蛍光抗体法により、腎臓の凍結切片を観察した結果、強く蛍光する細胞が多数観察された。