植物スクアレン合成酵素の大腸菌における発現と性状解析

• Project/Area Number: 07660441
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied molecular and cellular biology
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 畑 信吾 京都大学, 農学部, 助教授 (40238001)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 1995: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: シロイヌナズナ / ステロール生合成 / 融合タンパク質 / デヒドロスクアレン

Research Abstract

1.マウスのスクアレン合成酵素遺伝子をプローブにして、シロイヌナズナcDNAライブラリーを検索し、陽性クローンを得た。その塩基配列を決定したところ、410個のアミノ酸からなるオープンリーディングフレームが見い出された(分子量の計算値は47kDa)。
2.推定されるアミノ酸配列は、これまでに報告された酵母からヒトに至る他の生物種の本酵素と有意な相同性(42-44%)を示した。
3.ノーザンブロッティングによる解析において、mRNAのサイズは1.6kbであることが示された。
4.シロイヌナズナの酵素のコーディング領域全体をプラスミドpBluescriptllKS(-)にサブクローニングし、プラスミド上にコードされたβ-ガラクトシダーゼのN末端部との融合タンパク質を作れるようにした。この発現ベクターを導入された大腸菌の無細胞抽出液は、NADPHとMg^<2+>の存在下に、^<14>Cで標識されたファルネシルピロリン酸をスクアレンに転換する高い活性を有していた。
5.一方、NADPHが存在しないでMn^<2+>を加えた条件においては、この無細胞抽出液はデヒドロスクアレンを生成した。
6.マウスの本酵素を用いても同様な結果が得られたので、デヒドロスクアレンを副産物として生成する性質は、広く直核生物一般の本酵素に保存されていると結論した。

Research Products

• [Publications] T. Nakashima et al.: "Cloning, expression, and characterization of cDNAs encoding Arabidopsis thaliana squalene synthase." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92. 2328-2332 (1995)
• [Publications] H. Kouchi and S. Hata: "GmN56, a novel nodule-specific cDNA from soybean root nodules encodes a protein homologous to isopropylmalate synthase and homocitrate synthase." Mol. Plant-Microbe Interact.8. 172-176 (1995)
• [Publications] H. Kouchi et al.: "Distinct classes of mitotic cyclins are differentially expressed in the soybean shoot apex during the cell cycle." Plant Cell. 7. 1143-1155 (1995)
• [Publications] K. Izui et al.: "Enzymological evidence for the involvement of a calcium-dependent protein kinase in regulatory phosphorylation of PEP carboxylase in maize." Photosynthesis: from Light to Biosphere. 5. 163-165 (1995)