C型肝炎ウイルス(HCV)ゲノムの複製酵素RNAポリメラーゼの解析

Research Project

Project/Area Number	07670626
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Gastroenterology
Research Institution	Kanazawa Medical University
Principal Investigator	伊達孝保金沢医科大学, 医学部, 教授 (50019676)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	堤幹宏金沢医科大学, 医学部, 助教授 (00155425)
Project Period (FY)	1995
Project Status	Completed (Fiscal Year 1995)
Budget Amount *help	¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000) Fiscal Year 1995: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
Keywords	C型肝炎ウイルス / ゲノム / 遺伝子型 / 複製開始点 / 3′構造 / インタフェロン抵抗性株 / NS5A / 準変異株
Research Abstract	NS5B遺伝子産物の可溶化が困難なことから、当初予定した遺伝子産物の解析は据え置き、次の三点の研究を行い以下の結果を得た。 1.NS5Bによる複製開始点と考えられるHCVゲノムの3′端の構造を明らかにした。血清中のHCV-RNAの3′端にRNAリンカーを結合させたのち、リンカー部位からcDNAを合成し、リンカーとHCVのコーディング領域をPCR法で増幅して3′端領域を得て解析したところ、1)HCVの3′端は、ポリUにつづいて3′側にCUUリピート(あわせて約100b)、それに保存性の高いコアエレメント領域(100b)からなっていた。2)1b型には、U-OHとUUU-OHの異なる3′端が見られた。3)コアエレメント領域は3つのヘアピン構造からなる高次構造があるが、異なる遺伝子型間で見られる2-5塩基の違いは、いずれも3つのヘアピン構造を維持する塩基置換であった。4)現在、全HCV-RNA(約10kb)を試験管内で合成し、培養細胞へのトランスフェクション実験を行っているが、これまでのところ増殖するウイルスは得られていない。 2.INF抵抗性株と感受性株を簡単に見分ける方法を確立した。INF抵抗性に関連するNS5A領域(2209-2248)のみをSSCP法により分析したところ、INF抵抗性株型の一本鎖DNAは全て移動度が速く、感受性のそれは遅く、抵抗性株と非抵抗性株をSSCPの移動度のみでほぼ決定できることが明らかになった。 3.準変異株ごとにHCV全ゲノムをクローニングする技術を確立した。INF抵抗性決定領域を知る目的で、INF感受性株、抵抗性株HCVゲノムのcDNAを数百塩基重複した3つの断片に分けて増幅、クローニングした。それぞれの断片は、重複部分のSSCP移動度ごとに分類し、同一の移動度のものどうしを順にT7プロモータの下流に入れ、HCV-RNA合成ができるようにした。