| Project/Area Number |
07671184
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Hematology
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
広沢 信作 東京医科歯科大学, 医学部, 講師 (50143574)
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| Project Period (FY) |
1995
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1995)
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| Budget Amount *help |
¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
Fiscal Year 1995: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
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| Keywords | トロンボモジュリン / オールトランスレチノイン酸 / レチノイド / 内皮細胞 |
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| Research Abstract |
トロンボモジュリン(thrombomodulin.TM)遺伝子はエンドトキシン、組織壊死因子(tumor necrosis factor,TNF)やインターロイキン-1β(interleukin-1β,IL-1β)により発現が抑制され、ホルボールエステル、ヒスタミン、cAMPやレチノイン酸で発現が増強する。今回、レチノイン酸の、TMの発現制御に与える作用について、遺伝子レベルで検討した。
TM遺伝子の上流約2kb(キロ塩基)までを含むフラグメント(+145〜-2154)を用いて、制限酵素やBal31にて消化して様々な大きさのフラグメントを得た。これらの各フラグメントを、ルシフェラーゼ(luciferase,LUC)遺伝子をレポーター遺伝子としてもつベクター(pLUC)の上流に挿入して、様々な欠失コンストラクトを作製した。これらの各コンストラクトについてはシークエンスをおこなって5′端部位を決めた。レチノイン酸に反応するエレメントと類似する領域(RARE)が-400にみられ、この領域と同じ塩基配列をもつ、30bpのオリゴヌクレオチド(1RARE)と、繰り返しもつ、60bpのオリゴヌクレオチド(2RARE)を合成した。これらの合成オリゴヌクレオチドはプロモーター(SV40)をもつベクターpGL2promoterに挿入した。
トランスフェクションは株化されたヒト臍帯静脈内皮細胞(ECV340)にリポフェクチンによる方法で行った。オールトランスレチノイン酸(all-trans retinoic acid,ATRA)の添加実験はトランスフェクション後24時間経過してから添加して、その後さらに24時間培養を続けるようにした。細胞抽出液はルシフェラーゼアッセイに用いた。その結果、1RAREと2RAREのコンストラクトともに10^8-10^6Mの濃度で、濃度依存性に反応性が確認された。ATRAの他に、各種合成レチノイド(Am80など)の効果についても、更に検討していきたい。
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