網膜細胞におけるミトコンドリア遺伝子導入の試み

• Project/Area Number: 07671934
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Ophthalmology
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 小口 芳久 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (70051498)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 緋田 芳樹 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (10228695)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 1995: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
• Keywords: ミトコンドリア / 血小板 / 導入

Research Abstract

血小板を用いた生体組織における外来性ミトコンドリア導入の試み
ミトコンドリア遺伝子は核遺伝子と異なり、現在生体における遺伝子治療の方法論が確立しておらず、遺伝子治療の対象となりえていなかった。今回我々は容易にそして多量に調製できる血小板をミトコンドリアの供給源とし、外来性のミトコンドリアを生体組織へ導入する基礎技術の開発を目指した。
ミトコンドリアの受容側組織としてマウス腓腹筋を選択した。提供側の血小板溶液として、100μlあたり2mgの蛋白量を持つマウス及びヒト血小板を、10mMクエン酸ナトリウム・2%ポリエチレングリコール溶液に懸濁したものを用いた。異種蛋白による影響を調べるために、牛血清アルブミンを対照として用いた。100μlの血小板溶液及び対照溶液を27G針を用いてそれぞれのマウス腓腹筋内に注入した。翌日それぞれの筋肉標本を作製し、クライオトームを用いて10μm厚の凍結切片とした後、Gomori'Trichrome法を用いて染色した。
マウス腓腹筋にマウス血小板溶液を注入した標本にわずかな炎症細胞の浸潤が認められた。対照液である牛血清アルブミン溶液を注入した標本では、中程度の炎症細胞の浸潤が認められた。ヒト血小板溶液を注入した標本では、多数の筋細胞が融解し、単核細胞の著明な浸潤が認められた。
異種の血小板の注入による著名な細胞障害性が示された。対照液では炎症細胞の浸潤は認められたものの筋細胞の融解は認められなかったため、異種の蛋白に対する免疫反応のみではこの細胞障害性は説明困難であると思われた。また、マウス血小板溶液を注入した標本から、血小板そのものの障害性も否定された。このことから、外来性のミトコンドリアを導入するためには同種の血小板を用いる必要があるものと考えられた。
同種の場合、外来性ミトコンドリアが導入されたことを証明するためには、内在性のものと外来性のものとを区別する必要がある。そのために同種の2系統の実験動物間のミトコンドリア遺伝子の多型性を利用するのが最も簡易な方法と考えられるが、ミトコンドリア遺伝子の多型性については野性動物についての報告は散見されるものの、実験動物については報告がない。そこで現在、マウス(BALB/C, C57BL/6)、ラット(Winster,有色)、家兎(日本白色家兎、有色家兎)についてその多型性をRFLP法等を用いて検索中である。