P. loescheiiのgly-proペプチダーゼ遺伝子のクローニング

• Project/Area Number: 07672029
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Functional basic dentistry
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 早川 光央 日本大学, 松戸歯学部, 専任講師 (10112955)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 1995: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
• Keywords: prevotella loescheii / gly-pro aminopeptidase / λ ZAP Express / 歯周病 / クローニング

Research Abstract

◆歯周病関連菌のglycyl-prolyl aminopeptidase(GPase)は、申請者らのグループによって初めてP. gingivalisから分離・精製され、その後の研究により他の多くの歯周病関連菌も持っていることが解ってきた。特に、Prevotella loescheiiでは菌培養液および菌体内に非常に高い活性が認められ、しかもP. gingivalisのものとは性状を異にするものであることが判明した。本酵素のビルレンス因子として、細菌性コラゲナーゼとの共同作用によって結合組織の主要な成分、コラーゲンの破壊に関わっている可能性が示唆されており、グループの安孫子の本年度の別の報告書(一般研究 C)中に述べられている。
◆7年度中に得られた研究結果はおおよそ計画のように進行しており、次の通りである。
1.P. loescheii染色体DNAの精製と制限酵素による部分消化およびサイズ分画。
サイズ分画は従来のショ糖グラジェント法よりも短時間で簡便なアガロースゲル電気泳動法を確立する事が出来たので短報での投稿を準備中である。
2.in vitroパッケージング
計画ではコスミドを使って遺伝子バンクをつくる予定であったが、ファージの新しいタイプ(λ ZAP Express)に変更した。このファージは10以上のクローニングサイトを有し,多種の制限酵素を使える点であり、部分消化の片寄りを制限酵素の種類を変えることにより解消出来るとの考えである。PstIを用いたファージバンクからGPase活性をもつクローンが一つ得られた。しかし、DNA分析により10kbと長く高発現性プラスミドでは不安定であった。
3.酵素の精製と酵素学的知見
GPaseの精製は現在産生量が低く単一標品を得るに至っていない。また、酵素学的性質は粗酵素で検べたところ、ほぼP. loescheiiのものの性状に近似した結果が得られた。
以上の段階であるが、現在クローンの安定化を図っており、成功すれば一挙にタンパク質およびDNAの解析が出来るところに来ており、投稿準備を急いでいる。