環境中に極めて低濃度で存在する芳香族塩素化合物の微生物による無機化技術の開発

• Project/Area Number: 07680602
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 環境保全
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 片山 新太 名古屋大学, 農学部, 助教授 (60185808)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000); Fiscal Year 1995: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
• Keywords: PCR法 / 土壌DNAの抽出 / PCP(ペンタクロロフェノール) / pcpB遺伝子 / 基質添加効果 / pcp分解菌 / PCP分解活性 / Flavobacterium属菌

Research Abstract

本研究は、土壌から直接DNAを抽出し定量的PCR法によって増幅しペンタクロロフェノール(PCP)資化性菌を推定し、菌数を増加させPCP無機化活性を高めるのに適した土壌への添加基質を明らかにすることを目的とした。
1)土壌中のDNAの定量的PCR法の確立:PCP分解遺伝子(pcpB)のシークエンスをDNAデータベースとe-mail/DDBJを用いて比較し、最も特異性の高いプライマーを2組設計した。土壌中のDNAは、ドデシル硫酸ナトリウム入り緩衝溶液を用い凍結-融解法で抽出した。アガロースゲル電気泳動によりキメラDNAの可能性の高い10Kb以下のDNA断片を除いた後、スパンカラムで精製した。得られた土壌DNAをPCR法により増幅したところ、予想される大きさの増幅バンドが見られた。pcpB遺伝子を持つFlavobacterium属菌を土壌に添加し、そのpcpB遺伝子の増幅バンドを得るのに成功した。2組のプライマーでnested PCR法を用いることも可能となり、感度が高く培養法(4週間必要)に較べて迅速な(1日)分解菌の検出法が確立した。
2)各種基質の添加のPCP資化性菌数への影響:有機物添加により、PCP分解菌数は減少した。
3)分解速度の促進 一方、各種有機物の添加により、PCP分解速度は促進された。このことより、PCP分解菌は、土壌への基質添加により活性化されることが明らかとなった。
以上より、土壌のPCP分解活性は、基質の添加によって高まるものの、それはPCP分解菌数の増加によるものではなく分解菌の活性化によることが明らかにされた。分解菌数と分解活性が必ずしも相関しないことが今後のバイオレメディエーション技術における重要課題であることが明らかにされた。