分子シャペロンを活用したタンパク質再生反応・分離プロセスの開発

• Project/Area Number: 07750853
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 反応・分離工学
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 近藤 昭彦 神戸大学, 工学部, 助教授 (40205547)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1995: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 分子シャペロン / GroEL / GroES / グアニジン変性 / 熱変性 / リフォールディング / 固体化 / アフィニティ分離

Research Abstract

遺伝子工学的に大量生産されたタンパク質は立体構造が形成できずに、不溶性顆粒となる場合が多い。本研究では、タンパク質の立体構造形成を促進する触媒である分子シャペロンを大量に生産し、これを使って不溶性顆粒となったタンパク質から、正しい立体構造を持ち、活性のあるタンパク質を再生させる反応システムを構築することを目的とした。分子シャペロンとしては、大腸菌由来のGroEL/ESを用いた。まず、GroEL/ESを発現用プラスミドに組み込み、大腸菌DH5αにおいて大量発現を行った。GroEL/ESは、カゼイン固定化カラムを使用することで、高純度アフィニティ分離できた。これを用いて、グアニジン変性および熱変性させた酵素(エノラーゼ、DNAse、α-アミラーゼ)の再生反応特性を検討した。その結果、(1)GroEL/ESはATP存在下で再生反応を行う、(2)変性タンパク質に対してモル比で2倍以上のGroEL/ESを加えれば高い再生率を達成できる、(3)再生反応は37℃近傍で最も効率良く進行する、(4)タンパク質濃度を上げてもそれに応じてGroEL/ES量を増加させることで高い再生率を達成できる、(5)37℃以下ではGroEL/ESは安定である、などが明らかになった。そこで、GroEL/ESを活用した再生反応プロセスとして、(1)GroEL/ESをセルロースゲルに固定化して(Formyl-Cellulofineを利用)使用する、(2)再生反応後にGroEL/ESを固定化カゼインによりアフィニティ分離し再生利用する、の二つについて検討した。いずれの場合も、十分な活性を保ちながら繰り返し再生反応が行えるとともに、再生酵素を分離できたことから、その有効性が明かとなった。