低温域温度応答性IgGを用いたアフィニティ沈澱法による免疫特異的結合蛋白質の精製

Research Project

Project/Area Number	07750880
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	生物・生体工学
Research Institution	University of Toyama
Principal Investigator	星野一宏富山大学, 工学部, 助手 (20222276)
Project Period (FY)	1995
Project Status	Completed (Fiscal Year 1995)
Budget Amount *help	¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 1995: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Keywords	温度刺激応答性高分子 / アフィニティ精製 / 免疫グロプリンG / Protein A
Research Abstract	現在まで申請者が検討してきた温度のわずかな刺激に対して溶解性が可逆的に変化する可溶・不溶可逆固定化酵素の研究成果を踏まえて、低温域温度応答性アフィニティ吸着体を調製し、有用な生化学物質の分離・精製に適用すること検討した。すなわち、精製目的物質である免疫特異的蛋白Protein Aを黄色ブドウ状細菌Staphylococcus aureusの破砕物(粗蛋白液)から直接分離・精製するために4℃から10℃程度の低温域で溶解性が可逆的に変化し、かつ温度応答性高分子の側鎖にヒト免疫グロブリンGのFc領域を有する低温域温度応答型の可溶・不溶可逆アフィニティ吸着体を新規に開発する。この吸着体の温度応答性とProtein Aに対する親和性を利用したアフィニティ沈澱法により、Protein Aを効率よく高純度に精製することを検討し、以下の成果を得た。 1.低温域温度刺激応答性高分子調製用のモノマーとしてAcryloyl piperidine(APp)等を合成した。さらに、このモノマーとグリシジルメタクリルレート(GMA)を用いた溶液重合により高分子側鎖にエポキシ基を有する機能性高分子[Poly(APp-co-GMA)]を調製した。本高分子は、可逆的に4℃以下で可溶状態、また、8℃以上で完全に不溶状態となる性質を有していた。 2.合成した温度応答性高分子に、アフィニティリガンドであるヒト免疫グロブリンGのFc領域を固定化することにより、低温域温度刺激応答性IgGを調製した。本吸着体の温度応答も、高分子の温度応答にほぼ等しかった。 3.本吸着体をProtein Aの精製に利用した場合、pH7.0、2℃の条件において最大吸着を示し、吸着体当たりの吸着量は・解離特性を検討する。さらに、吸着体に結合したProtein Aの解離方法について吸着量は、3.0x10^<-8> mol/g-吸着体となった。さらに、目的タンパク質が吸着した吸着体は、10℃にすることによって完全に不溶化し、遠心分離により回収することができた。 4.本吸着体に結合したProtein Aの解離に、ジメチルアミンの添加が有効であり、0.05Mの濃度で1時間放置することにより、完全に吸着体から分離回収することができた。