キュウリ篩管汁液特異的リポキシゲナーゼ分泌機構の解明 〜その生物工学への利用を目指して〜

• Project/Area Number: 07760088
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 応用微生物学・応用生物化学
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 松井 健二 山口大学, 農学部, 助教授 (90199729)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1995: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: リポキシゲナーゼ / キュウリ / 篩管 / cDNA

Research Abstract

リポキシゲナーゼ(LOX)はリノール酸やリノレン酸などの不飽和脂肪酸に酸素添加し、脂肪酸ヒドロペルオキシドを生成する酵素である。本酵素は植物一般に広く存在するが、本酵素の生理的役割についての明確な回答はまだ得られていない。LOXは様々な組織に様々なアイソザイムが存在し、その各々が異なった生理的役割を担っているものと考えられている。その中でも興味深いことに、キュウリ篩管汁液に含まれる蛋白質のうちほぼ90%までもがLOXで占められている。本研究では、(1)篩管特異的LOXがどのような機構で局在するのか、(2)LOXが篩管に存在する生理的な意味は何か、を解明することを目的とした。この目的のため、篩管特異的LOXを精製し、その性質を明らかにすると共に、そのcDNAクローニングを試みた。
篩管汁液は発芽2カ月のキュウリ葉柄から採集した。このものを透析後、HPLCにて分離、精製した。その結果、篩管汁液LOXは等電点が異なるが、サブユニットサイズが同じ約93kDのふたつのアイソフォームからなることが解った。そのうち、主要なアイソフォーム(peLOX1)の至適pHは5-6で、そのpH-活性カーブはキュウリ根特異的LOXのそれと酷似していた。精製したpeLOXの内部配列を自動エドマン分解により決定したところNH3-YAMELLLNLYGXG-COOHであった。この配列はこれまでキュウリより単離されたcotLOX、rootLOXのどちらとも60%程度の相同性しかなく、新たなアイソザイムであることが明らかとなった。現在、この部分アミノ酸配列を元にデジェネレイトプライマーを作製し、キュウリ茎mRNAからRT-PCRにより、peLOX cDNAのクローニングを進めており、これまでに部分長cDNAを得た。また、平行してキュウリゲノムライブラリーからこれまでに数種のLOX遺伝子を単離しており、peLOXの篩管特異的発現を制御しているであろう遺伝子プロモーター領域の検索、組み換え技術を用いたプロモーターアッセイを精力的に進めている。これらの成果については現在投稿準備中である。