| Research Abstract |
はじめに,生理活性を持つイヌIL-8 (cIL-8)の作製を行った.当初,マルトース結合蛋白(MBP)とcIL-8との融合蛋白(MBP-cIL-8)を作製・精製してそこからfactor XaによりcIL-8のみを切り出す予定であった.しかし,融合蛋白が酵素によって完全消化できないこと,および切り出されたcIL-8がクロマトグラフィーで融合蛋白と同じ分画に溶出されることから,cIL-8のみを精製することができなかった.そこで,大腸菌に導入し,グルタチオン-S-転移酵素(GST)とcIL-8の融合蛋白(GST-cIL-8)作製したところ,本蛋白は,factor Xaにより完全消化され,CMカラムにより,cIL-8のみの分画を得ることができた.得られたcIL-8を最終濃度が18ng/mlおよび180ng/mlとなるようにイヌ好中球に加えたところ,いずれの濃度においてもcIL-8の添加により好中球の形態変化が誘導され,得られたcIL-8生理活性を有することが示された.また,上記2つの融合蛋白を用いて,cIL-8に対するポリクローナル抗体(polyAb)およびモノクローナル抗体(monoAb)を作製した.polyAbは,ウサギをMBP-cIL-8で免疫し,その血清をGST-cIL-8を結合したセファロースカラムを通し,cIL-8に反応する抗体のみを精製した.得られたpolyAbは,ELISA法およびウエスタンブロッティング法においてcIL-8と反応し,さらに,ヒトIL-8とはELISAにおいてのみ反応した.また,このpolyAbは,cIL-8による好中球の形態変化は中和したが,ヒトIL-8による形態変化は中和しなかった.抗cIL-8monoAbは,マウスをMBP-cIL-8で免疫し,X63 Ag8ミエローマ細胞と融合し,得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をGST-cIL-8抗原を用いたELISA法によりスクリーニングした.その結果,14クローンの抗cIL-8monoAb産生ハイブリドーマを得た.現在,抗cIL-8monoAbの中和活性,cIL-8測定系の確立およびcIL-8の好中球のリーシュマニア原虫貧食に対するcIL-8の効果を検討中である.
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