標識したcDNAの導入による筋原線維形成機構の解析に関する形態学的研究

• Project/Area Number: 07770005
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: General anatomy (including Histology/Embryology)
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 小宮山 政敏 千葉大学, 医学部, 助手 (70175339)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1995: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 筋原線維 / ミオシンアルカリ軽鎖 / アイソフォーム / エピトープタグ / 螢光抗体法 / 共焦点レーザー顕微鏡 / キメラ

Research Abstract

ミオシンアルカリ軽鎖(LC)には、速筋型(1fと3f)、遅筋型(1sa)、遅筋/心室筋型(1sb)、非筋型(3nm)など多数のアイソフォームが存在し、それらの発現が筋細胞の発生過程にしたがって変化することが知られている。本研究では、同一細胞内に複数のアイソフォームが存在した場合、それらの筋原線維への組み込まれ易さに違いがあるのかどうかを調べるために、新生ラットおよび成熟ラットの培養心室筋細胞においてこれらのcDNAを2種類ずつ発現させ、アイソフォーム毎の筋原線維への局在化傾向の違いを同一細胞内で直接比較した。導入するcDNAに予め異なるエピトープタグを組み込んでおくことにより、発現したアイソフォームをそれらタグに対する抗体で識別し、LCアイソフォームの分布を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、筋原線維への局在化傾向は3nm、1sa、1sb、1f、3fの順に強くなることが明らかになった。筋細胞の発生過程におけるLCアイソフォーム変換の順序は、この局在化傾向の強まる順序に類似している。これらのことから、アイソフォームの移行期においては後から発現したアイソフォームが優先的に筋原線維に組み込まれ、その変換が速やかに行われることが考えられた。
次に、蛋白質のどの部分(アミノ酸配列)がアイソフォーム特有の局在化傾向に関与しているのかを調べるために、アイソフォームどうしで一部を交換したキメラcDNAを作製し、上記と同様の実験を行った。その結果、タイプ3のLC(3f、3nm)ではN端半分、タイプ1のLC(1f、1sa、1sb)ではそれに対応する中央部の約70個のアミノ酸が筋原線維への局在化傾向の違いに重要であることが明らかになった。今後この部位をさらに詳しく解析し、LCの局在に重要なアミノ酸配列を決定して行きたい。