精巣機能を制御する新しい細胞外マトリックスタンパクの検索

• Project/Area Number: 07770013
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: General anatomy (including Histology/Embryology)
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 矢間 太 横浜市立大学, 医学部, 助手 (00254160)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1995: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: ラット / 精巣 / 細胞外マトリックス / IV型コラーゲン / ラミニン / モノクローナル抗体 / SDS-PAGE / ウエスタンブロッティング

Research Abstract

私たちは、ラット精細管細胞外マトリックス(ECM)成分を抗原に用い、マウスに免疫して幾つかのモノクローナル抗体を作成した。これらの抗体の中で精巣特異性を示すものが存在しているかを、ラット8組織(精巣・肺・肝臓・小腸・心筋・骨格筋・腎臓・脳)において蛍光抗体法を用いてスクリーニングを行った結果、12G11と言う抗体が精巣特異性を示した。この抗体を用いて凍結超薄切片法による免疫電顕を行なった結果、12G11の抗原タンパクは精細管基底膜と、筋様細胞の基底膜に局在していることが確認された。生化学的にも12G11のの精巣特異性を確認するために、同様の8種類の組織からECM成分をそれぞれ単離し、これを8モル尿素、2%メルカプトエタノールで可溶化し、この可溶化分画をアガロース電気泳動法によって分離し、次いで電気泳動的にタンパクをニトロセルロース膜に転写させ、12G11と反応させた。この結果から、生化学的にも12G11の精巣特異性が示された。アガロース電気泳動法において12G11が認識するバンドをアガロースゲルを直接切り出すことによって回収し、これを5%SDS-PAGEで分析した結果、このバンドには210、200、185および175-kDのタンパクが含まれていることが確認された。これらのバンドが分子量の大きい方からラミニンのB1・B2鎖、IV型コラーゲンのα1(IV)・α2(IV)鎖であることをウエスタンブロッティングで確認した。12G11はこれらのどのバンドにも反応を示さず、フロント部分に反応が認められたので、12G11の抗原タンパクの分子量を推定するために10%SDS-PAGE、ウエスタンブロッティングを行なった。この結果から、12G11の抗原は27-kDであることが推定された。以上の結果から、12G11が認識しているタンパクは、ラミニンやIV型コラーゲンと挙動を供にすること、今までには報告のない低分子量の精巣特異的なECMタンパクであることが示唆された。私たちは今、27-kDタンパクが単一タンパクであることを証明するために、ラット精巣ECM成分の二次元電気泳動法の確立に努力している。糖タンパクを含むECM成分の二次元電気泳動はその条件設定に予想以上の困難を強いられているが、二次元電気泳動法が確立出来れば、12G11が認識する27-kDタンパクの解析が完結すると考えている。