| Project/Area Number |
07770473
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Neurology
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
平沢 恵理 (有川 恵理) 順天堂大学, 医学部, 助手 (50245718)
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| Project Period (FY) |
1995
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1995)
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| Budget Amount *help |
¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 1995: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | ジストロフン / アンチセンスオリゴ / revertant fiber / Duchenne型筋ジストロフィー / 免疫組織化学染色 |
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| Research Abstract |
1.イントロン配列の決定とアンチセンスオリゴの作製
mdxではエクソン23にpoint mutationが存在しこれがstop codonとなりジストロフィンが欠損している。そこでエクソン23をskipするsplicingを作らせるためのアンチセンスオリゴを決めるためエクソン23の配列をプライマーとして利用するreverse PCR法を用いイントロン23の配列を決定した。既知のアンチセンスオリゴはエクソン23へのスプライシングのacceptor siteを隠すように設計した。
2. mdx筋培養系の作製とアンチセンスオリゴ処理
増殖能の高い胎児筋を取りだし、grouth mediumでconfluentになるまで培養し分化誘填導の際のdexamethazoneとアンチセンスオリゴで処理した。
3.培養系でのジストロフィン陽性細胞の確認
ジストロフィン免疫組織化学染色による蛋白質の確認とRT-PCR法によるスプライシングの変化の確認を組み合わせて確認することにした。N末端からC末端までの異なるドメインを認識する4種類の抗ジストロフィン抗体を用いた免疫組織化学染色を行い陽性細胞の頻度からアンチセンスオリゴの効率の評価を試みたが、ジストロフン発現時期のmyotubeになると細胞が剥がれ生存が困難になり十分量の細胞が得られなかった。方法の検討が必要となり現在mdxマウスを用いたin vivoでの実験系で検討中である。
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