ヒトLH/CG受容体蛋白結合糖鎖の人為的変異による分子生物学的構造機能解析

• Project/Area Number: 07771377
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Obstetrics and gynecology
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 房 正規 神戸大学, 医学部・附属病院, 助手 (40243315)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 1995: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: ヒトLH / CG受容体 / アスパラギン結合糖鎖 / Site-directed mutagenesis / シグナル伝達

Research Abstract

ヒトLH/CG受容体(LH/CG-R)の6箇所のアスパラギン結合糖鎖結合可能部位(Asn99、174、195、291、299、313)に、site-directed mutagenesisを用いてアミノ酸を人為的に変異させ、糖鎖の結合を阻害する事により、その糖鎖がリガンドの結合親和性やシグナル伝達にどのように関与しているかを、レセプターアッセイ、cyclic AMP測定を行ない検討した。
まず、これまでの研究で得られたヒトLH/CG-R cDNAをM13に組み込み1本鎖DNAを得た。この糖鎖結合可能部位にAsn-X-Ser or Thrのコンセンサス配列のAsnが、Aspに置換されるようにオリゴヌクレオチドを設計し、LH/CG-R cDNAに突然変異を導入した。
この遺伝子断片を発現ベクターpCMXに制限酵素、修飾酵素をもちいて組み込み、このpCMXLHRmutをLarge preparationにより精製した。
これをヒト培養細胞293 cellにカルシウム燐酸法により遺伝子導入し、transiennt expressionにより変異レセプターを発現させた。標識hCGを用いてレセプターアッセイを行なった。さらにhCG添加後の細胞内cyclic AMPを測定し、シグナル伝達能の変化を検討した。
この結果、それぞれの変異レセプターのhCG結合親和性はKd=200〜300pMであり、Wild-typeの値(Kd=250±25pM)とほぼ同等であった。またcyclic AMP産生量はWild-typeの値(0.01fmol/binding site)とほぼ同等の0.01〜0.02fmol/binding siteであった。このことからヒトLH/CG受容体アスパラギン結合糖鎖はラットLH受容体と異なり、ホルモン結合能、シグナル伝達能には関与しないことが示唆された。