電気穿孔法による口腔細菌の耐酸性遺伝子のS.sanguisへの導入と発現

• Project/Area Number: 07772012
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 矯正・小児・社会系歯学
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 畑 真二 東北大学, 歯学部, 助手 (20208507)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 1995: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: う触 / 口腔レンサ球菌 / plasmid / 耐酸性遺伝子

Research Abstract

ウ触象牙質からの耐酸性細菌の単離
歯垢からはpH4の寒天培地に成育する細菌を分離することはできなかったが、ウ触象牙質からはpH4の寒天培地に成育する細菌を単離することができた。同定の結果Streptococcusであることがわかったが、Bergeyのマニュアルのどの口腔レンサ球菌にも属さないことが判明した。
S.sanguis ATCC 35105の低pH感受性mutantの作成
S.sanguis ATCC 35105はplasmidにより形質転換可能な口腔レンサ球菌である。通常pH5.5の寒天培地に成育するが、Ethyl methansulfonate処理によって突然変異させ、pH5.5の寒天培地に成育しないmutantを得ることができた。
S.sanguis ATCC 35105を形質転換するplasmidの開発
3種類のLactococcus lactisより3種類のplasmidをAnderson & McKayの方法により抽出した。pGB301,pIL252,pIL253である。pIL253が最も回収率が良く、unique restriction siteも多いが、形質転換効率はpGB301が最も優れていることがわかった。
分離した耐酸性口腔レンサ球菌、S.mutans, S.sobrinus, S.sanguisからchromosomal DNAを抽出し、制限酵素で部分消化の条件を夫々に検討した。現在、完全消化および部分消化した1-5Kbのchromosomal DNAを3種類のplasmidにligationし、mutant S.sanguis ATCC 35105を電気穿孔法により形質転換し、耐酸性を回復させる(pH5.5ないしpH5.4の寒天培地に成育するようになる)遺伝子を検索中である。