カイコを利用したヒトチトクロームP450大量発現系の確立

• Project/Area Number: 07857164
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biological pharmacy
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 佐久間 勉 北海道大学, 薬学部, 助手 (30250468)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1995: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 薬物代謝酵素 / チトクロームP450 / CYP2E1 / カイコ / バキュロキュロウイルス / 異種タンパク質発現系 / BmNPV / ヒト

Research Abstract

チトクローム450は薬物などの生体外異物の解毒的代謝や代謝的活性化を行なう第1相薬物代謝酵素であり、主に実験動物を用いて研究が行われてきた。しかし、ヒトの薬物代謝酵素に関する研究は試料入手の問題などからあまり進んでおらず、ヒトの薬物代謝酵素の研究は急務とされてきた。そこで、発現効率の高さや宿種特異性による安全性などから注目されているバキュロウイルス(BmNPV)を用いてヒトP450(CYP2E1)を大量に発現させることを試みた。
1.初めに組換バキュロウイルスを相同的組換えを利用し作製した。ヒトCYP2E1cDNAをpBKBlueベクターに挿入し、BmNPV染色体DNAと共にBm6細胞にトランスフェクションした。培養液上清より組換バキュロウイルスBmh2E1を精製した。
2.次にBmh2E1感染細胞内でのヒトCYP2E1発現を免疫化学的方手法および吸光スペクトルの測定によって確認した。Bmh2E1感染細胞は感染後96時間で最大の発現レベル(0.089nmol/mgタンパク質)を示した。培養液にヘミンを添加することによって発現レベルが上昇することも確認された。発現したヒトCYP2E1が酵素活性を有するか確認したところ、アニオンおよび7-エトキシクマリンを代謝した。また、酵素活性の比もヒト肝より精製されたものと同様な傾向を示したことから、細胞内で発現したヒトCYP2E1がヒト肝に存在しているものと同等であることが強く示唆された。
3.ヒトCYP2E1の大量発現を目的としてカイコ幼虫およびさなぎにBmh2E1を感染させたところ、カイコ幼虫およびさなぎにおいてもヒトCYP2E1が発現することが確認された。カイコのさなぎからのヒトCYP2E1の回収率は175pmol/headであった。感染の方法・時期・精製方法の改良が出来れば有効な発現系になると考えられた。