| Project/Area Number |
08249215
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
青野 重利 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助教授 (60183729)
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| Project Period (FY) |
1996
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1996)
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| Budget Amount *help |
¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
Fiscal Year 1996: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
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| Keywords | 転写調節因子 / プロトヘム / センサー蛋白質 / シグナル伝達 / 鉄・硫黄クラスター |
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| Research Abstract |
最近、新規な転写調節因子として、分子中に遷移金属イオンを含む転写調節因子の存在が報告され始めた。本研究では、そのような遷移金属含有型転写調節因子のうち、大腸菌由来のSoxRタンパク、および光合成細菌由来のCooAタンパクを対象とし、これらの転写調節因子の機能発現において、その分子中の金属イオンが果たす役割、金属サイトの構造等を明らかにすることを目的として研究を行なった。
大腸菌JM109株のクロモソームDNAを鋳型としたPCRによりSoxR遺伝子を単離し、これをtacプロモーターを有するpKK223-3にクローニングすることにより、SoxR発現ベクターを調製した。本発現ベクターを用い、大腸菌中でSoxRを発現させることに成功した。発現したSoxRを精製し、その電子吸収スペクトルを測定したところ、[2Fe-2S]クラスターに特徴的なシグナルを示した。また、電子スピン共鳴スペクトルにおいても[2Fe-2S]クラスターの存在を確認することができた。
SoxR中には、鉄硫黄クラスターの配位子として機能すると考えられるシステインが4個所、存在する。これらのシステムが、実際に鉄硫黄クラスターの配位子となっているかどうかを確かめるため、部位特異的変異導入により、これら4個所のシステインをセリンに置換した変異型タンパクを調整した。その結果、これら4種の変異型SoxRは,すべて分子中に鉄硫黄クラスターを含まない、アポ型として発現することがわかった。このことから、分子中に存在する4個のシステインは、すべて鉄硫黄クラスターの配位子として機能していると考えられる。
CooAについても同様に、大腸菌における発現系の構築を行ない、その発現に成功した。精製したCooAは、ヘムタンパクに特徴的な電子吸収スペクトルを示した。
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