標的遺伝子組換え法による受精の分子機構の解析

Research Project

Project/Area Number	08252201
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	馬場忠筑波大学, 応用生物化学系, 助教授 (40165056)
Project Period (FY)	1996
Project Status	Completed (Fiscal Year 1996)
Budget Amount *help	¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000) Fiscal Year 1996: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000)
Keywords	受精 / アクロシン / アクロソーム / 精子 / セリンプロテアーゼ / 卵透明帯
Research Abstract	精子に局在するトリプシン様セリンプロテ-ゼアクロシンは、受精の際に卵透明帯を限定分解して精子の卵への侵入を容易にさせるものと考えられてきた。標的遺伝子組換え法を用いてアクロシンを欠損する変異マウスを作製・解析した結果、その変異マウスは野生種と同等の自然交配能を有していることが判明した。しかし、このアクロシン欠損マウス精子を用いて体外受精試験を行うと、野生種のものよりも卵透明帯への精子の侵入にわずかな遅延が認められた。また、アクロシン以外の新規セリン系プロテ-ゼ(カッパイン)が精子に存在することも見い出された。このマウスカッパインの構造と受精での機能・役割を明確にする目的で、カッパインをコードするcDNAと染色体遺伝子クローンの単離と解析、および細胞内局在に関する研究を行った。マウスカッパインは前駆体プロテアーゼとして合成され、36残基の軽鎖と300残基の重鎖がひとつのジスルフィド結合により連結されているような成熟型酵素にプロセシングされることが明らかとなった。マウスカッパイン遺伝子は、全長約5キロ塩基対で5個のエクソンより構成されており、マウス染色体上でシングルコピーとして存在することも明らかとなった。また、カッパイン遺伝子は精巣特異的に発現しており、精子形成過程ではほかのアクロソームタンパク質遺伝子と同様にパキテン期精母細胞ですでに転写が開始しており、半数体精細胞でその発現が最も盛んであった。組織化学的な観察より、カッパインはアクロソーム下部、あるいはアクロソームと接する赤道部上端に沿った限定された部位に局在していることが判明した。このカッパインの生体内機能解析のために、ターゲティングベクターを構築してES細胞経由で遺伝子相同組換えを試み、目的のES細胞クローンを単離後、キメラマウスを得ている。