| Project/Area Number |
08255247
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
高橋 健治 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (70011533)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小島 正樹 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (90277252)
井上 英史 東京薬科大学, 生命科学部, 助教授 (20184765)
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| Project Period (FY) |
1996
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1996)
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| Budget Amount *help |
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 1996: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
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| Keywords | ハロゲン化炭化水素 / 脱ハロゲン化 / グルタチオンS-トランスフェラーゼ / 蛋白工学 / 部位特異的変異 / X線結晶構造解析 / 活性部位残基 / 環境汚染物質 |
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| Research Abstract |
1.本研究の一環として、大腸菌グルタチオンS-トランスフェラーゼ(以下GST)の三次元構造をX線結晶構造解析により明らかにした。この結果、全体的な構造、構造形成やグルタチオン(GSH)の結合に関与すると考えられる残基は他生物種由来のGSTと共通性があることから、同一の起源から進化した酵素であることが示された。
2.α,μ,πおよびσクラスGSTで触媒機構に関与することが明らかにされているTyr残基は、一次,二次構造的には大腸菌GSTにも保存されているが、立体構造的には触媒機構に関与し難い方向を向いており、本申請者が部位特異的変異により示したこのTry残基が活性発現に関与しないという推定が支持された。また、最近昆虫由来GSTの触媒残基の一つとして提唱されているSer残基も大腸菌GSTでは一次構造上保存されてはいるものの、部位特異的変異(Ser→Ala)では活性発現に関係しない結果を得、立体構造的にも支持される結果が得られた。一方、部位特異的変異により、His106の側鎖の重要性が示唆された。X線構造解析の結果を合わせると、His106の側鎖とCys10の主鎖のN原子がGSHのチオール基の近傍に位置し、触媒機構に関与する可能性が考えられる。したがって、GSTファミリーは活性部位の構造から少くとも3つのグループに分類される可能性が示唆された。
πクラスGSTの基質特異性に関与する構造を明らかにするために、部位特異的変異およびキメラ酵素の作製による検討を行った。この結果、ラットGSTP1-1のGly104をIleに置換することにより、1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンに対する活性を高めることができた。この残基はすでに推定した161位残基とともに104位残基が1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンの結合に関与することを示唆している。
4.GSTの機能変換を高速進化法により行う実験系確立のために、大腸菌GST遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換する研究を進めた。
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