テトラサイクリン/プロトンアンチポ-タの結晶化とX線構造解析

• Project/Area Number: 08268224
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 三木 邦夫 京都大学, 大学院理学研究科, 助教授 (10116105)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北所 健悟 京都大学, 理学部, 助手 (60283587) ; 喜田 昭子 京都大学, 大学院理学研究科, 助手 (70273430) ; 樋口 芳樹 京都大学, 大学院理学研究科, 助教授 (90183574)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1996: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: 細胞膜輸送 / アンチポ-タ / テトラサイクリン / 結晶化 / X線構造解析 / タンパク質結晶学

Research Abstract

本研究は,細胞膜輸送の分子機構を原始レベルで解明することを目的として,テトラサイクリン/プロトンアンチポ-タ(TetAタンパク質)の結晶化とX線結晶構造解析を行い,その完全な三次元立体構造を決定するものである.
今年度は,引き続きテトラサイクリン耐性の強いグラム陰性菌のTetAタンパク質(分子量42kDa,アミノ酸残基数401),タンパク質の親水性部分を増加させたタンパク質(デヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をTetAタンパク質のN末端に融合させたタンパク質)を研究の対象として結晶化条件の検索を行ってきた.その結果,界面活性剤としてドデシルマルトシド,沈殿剤としてポリエチレングリコール‐モノメチルエーテル550,添加剤に硫酸亜鉛を用い,温度20度,pH6.5で結晶化を行ったとき,1辺の長さが約0.15mmの板状結晶が得られた.本結晶は,蒸気拡散でアモルファス沈殿状になったタンパク質溶液の中から析出したものである.回転対陰極型のX線発生装置を用いてX線回析実験を行い静止写真を数枚撮影したところ,低分解能の反射を確認できた.この反射が由来する面間隔は約40Aであり,低分子結晶由来の反射と比べると少々大きなものであったが,それがTetAタンパク質由来のものであるかどうかの判断はできなかった.この結晶は結晶化の再現性に乏しいため,新たな結晶化条件の検索に加えて結晶化の再現性を高めることが今後の重要な課題である.