| Project/Area Number |
08272213
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
吉村 徹 京都大学, 化学研究所, 助教授 (70182821)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
栗原 達夫 京都大学, 化学研究所, 助手 (70243087)
江崎 信芳 京都大学, 化学研究所, 教授 (50135597)
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| Project Period (FY) |
1996
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1996)
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| Budget Amount *help |
¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
Fiscal Year 1996: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
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| Keywords | アラニンラセマーゼ / 断片型酵素 / ドメイン / リフォルディング / 高次構造形成 |
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| Research Abstract |
Bacillus stearothermophilus由来の耐熱性アラニンラセマーゼ(ホモ2量体)のサブユニットは、2つのドメインから構成され、N‐末端側ドメインは、補酵素ピリドキサール5'‐リン酸(PLP)が中心に位置するTIMバレル構造をもつコア部分からなり、C‐末端側ドメインの大部分はβ鎖からなる。限定分解の結果をもとに構築した断片型遺伝子の産物(断片型酵素)は、それぞれN‐末端側、C‐末端側ドメインに相当する2つのN‐,C‐断片からなるα2β2型4量体であり、酵素学的諸性質は野性型酵素のそれとほとんど差がない。本研究では、高次構造形成とドメイン構造の関係を明らかにするため、本断片型酵素の再構成過程を解析し、その高次構造形成機構を調べた。まず変性剤存在下で断片型酵素からN‐、C‐断片を分取した。希釈法によりN‐またはC‐断片を単独で折りたたませるか、あるいは、その系に変性状態のもう一方の断片を経時的に添加した。活性回復を示標にして断片型酵素の再構成を追跡したところ、C‐断片の活性回復能は経時的に失われていくのに対し、N‐断片の活性回復能は長時間保持されることが示された。断片型酵素の再構成はPLPに依存せず、その至的適pHは10.0付近であった。このpHにおいて単独で折りたたませたN‐断片は遠紫外部にのみCDを示すこと、また、励起波長280nmにおいて変性状態の場合と異なる蛍光極大を示すことから、このN‐断片は何らかの2次構造を有し、密な構造であるが、特定の3次構造はもたないと推論された。また吸収スペクトルからPLPの結合能はないものと推察された。単独で折りたたませたN‐断片に変性C‐断片を加えた場合には、N‐断片の3次構造形成が起こり、PLP結合能が回復することから、C‐断片はN‐断片の高次構造形成を補助する機能を持つと考えられる。
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