多糖化による卵白リゾチームの安定化と不安定変異体の高発現

• Project/Area Number: 08272222
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 加藤 昭夫 山口大学, 農学部, 教授 (00035114)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 1996: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: グリコシル化リゾチーム / カルネキシン / 酵母発現系

Research Abstract

本研究者は多糖化リゾチームを酵母発現系で分泌させると、見かけの構造の安定性が増加すること、プロテアーゼに耐性を示すことを明らかにした。これらの結果は、多糖化により、微量かあるいは全く分泌しない不安定変異リゾチームを高分泌できることを示しており、今年度はこの手法を用いることにより、不安定なSS結合除去変異体(C76/94A)、α^-ヘリックス双極子不安定化変異体(K13D)、分子内疎水性パッキング低減化変異体(I55V)を分泌させ、その後多糖鎖を除去することにより、通常の手段では発現できない変異体の折れたたみ機構を研究した。その結果、次のような知見が得られた。
(1)少量しか分泌しない変異体リゾチームcDNAを部位指定変異により活性中心から離れた分子表面(49位および19位)にN型糖鎖認識配列Asn-X-Thrを導入するように改変し、これを酵母発現ベクターに組込み、形質転換した酵母を用いて大量に培養し、培養液に分泌した多糖化リゾチームをカチオン交換樹脂(CM-トヨパール)に吸着させ、溶出させた。こうして得られた種々の不安定変異体(SS結合除去変異体、ヘリックス不安定化変異体、分子内疎水性パッキング低減化変異体)は多糖化しても、高分泌しなかった。
(2)この結果は糖蛋白質に特異的な分子シャペロンカルネキシンによる品質管理によるものと推測し、カルネキシンを欠損させた変異株を用いて、分泌を試みたところ高発現、分泌させることができた。