| Project/Area Number |
08273211
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
大山 莞爾 京都大学, 農学部, 教授 (40135546)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福澤 秀哉 京都大学, 農学部, 助教授 (30183924)
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| Project Period (FY) |
1996
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1996)
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| Budget Amount *help |
¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 1996: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
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| Keywords | ゼニゴケ / PACライブラリー / FISH / 性染色体 / CDPK / alternative splicing / サブトラクション / fingerprinting |
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| Research Abstract |
ゼニゴケの雌培養細胞のYACライブラリーを作製することを試み、50〜750kbのインサートを持つYACクローンを23個得た。約50kbと約500kbの2種類のクローンをプローブに用いたFISHに成功した。しかし、YACのクローニングの効率が低いこと、そのままではシ-クエスができないことなどから、P1由来人工染色体(PAC)にベクターを変えてライブラリーを作製することにした。PACライブラリーの材料には雌雄の葉状体を用いた。現在までに20〜150kbのインサートを持つクローンを1000個程度得ている。約50kbのインサートを持つPACクローンをプローブに用いたFISHでシグナルが得られたため、残りのクローンの中から性染色体にヒットするクローンを探している。
雌雄のゲノムの違いを検出するために、雌雄葉状体のゲノムDNAを鋳型にしてRAPDPCRを行い得られたDNA断片の塩基配列を決定したところ、Ca^<2+>依存型タンパク質リン酸化酵素(CDPK)と相同性のある遺伝子が見つかった。雌培養細胞のゲノムにおいてCDPKの全塩基配列を決定したところ、6番目のエキソン(6A,6B)が重複して存在しており、これらをalternativesplicingによって使い分けていると予想された。そこで、雌雄培養細胞、葉状体、生殖器官より抽出したmRNAを用いて、エキソン5と7の間をRT‐PCRにより増幅してその塩基配列を決定した。すると、いずれの器官においてもエキソン6Aのみを持つmRNAと、エキソン6Bのみを持つmRNAが作られていることが確認され、実際にalternative splicingがおこなわれていることが明らかになった。
雌性生殖器官と葉状体とのcDNAサブトラクションにより3種類の新規な遺伝子の断片が得られているほか、RNAfingerprintingによって多数の生殖器官特異的なcDNA断片を得ている。現在、これらのcDNA断片を含む全長cDNAクローンを単離するためmRNAを調整し、cDNAライブラリーの作製を試みている。
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