カイコ前胸腺刺激ホルモンのNMRによる立体構造解析と機能相関

• Project/Area Number: 08276218
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 永田 宏次 財団法人東京都臨床医学総合研究所, 生理活性物質研究部門, 研究員 (30280788)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1996: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: 前胸腺刺激ホルモン / 立体構造解析 / 結晶化 / 脱皮 / 変態 / 昆虫

Research Abstract

カイコ前胸腺刺激ホルモン(PTTH)の分子量は活性に不要な糖鎖を除いて約25kDaであり、多次元NMR法を用いても立体構造決定が容易でないこと、および、現在までの決定されているシスチンノットファミリーの立体構造はすべてX線結晶解析法により解かれていることから、PTTHの立体構造解析法としてX線結晶解析法の方が妥当であると判断し、PTTHの結晶化の条件検討を散在行列(sparse matrix)法により進めた。
結晶化条件検討キットCrystal Screen (Hampton Research)を用いて50種類の塩緩衝液・沈殿剤の組み合わせのもとで初期スクリーニングを行い、いくつかの条件下で微結晶を得ることができた。特に、緩衝液としてNaHepes pH7.5、沈殿剤としてPEG4000あるいはNa citrateを用いた場合に最良の結果が得られた。今後、結晶化条件を精密化することにより、構造解析に用いる質の高い結晶が得られると期待される。
また、結晶化に用いる試料タンパク質の安定供給のために、新たに発現系を構築した。6xHis融合カイコPTTHを大腸菌で発現し、封入体を6M尿素で可溶化後、Ni^<2+>固定化樹脂で精製した。この特異的親和性を利用する簡便な精製により大量の組み換えPTTHを安定して調製できるようになった。この方法により得られた組み換えPTTHを用いて、従来よりも効率良く結晶化の条件の精密化を進めることが可能になった。