膜結合性蛋白のcDNAを単離するための新しいベクターの開発

• Project/Area Number: 08283221
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Fujita Health University
• Principal Investigator: 市原 慶和 藤田保健衛生大学, 総合医学科研究所, 講師 (80176304)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 1996: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: ベクター / cDNA / 膜結合蛋白

Research Abstract

METベクターを用いて脳神経系に発現している新しい膜結合タンパクを見出すことを最終目的として、マウス脳のMET-cDNAライブラリーを作成した。まずマウス胎生13日胚の大脳からpoly(A)+RNAを抽出した。リンカープライマー法を用いてmRNAから1本鎖cDNAを合成した。本リンカープライマーはcDNAが逆方向に挿入された場合、いずれかのフレームで終始コドンにあたるように工夫してある。METベクターはBstXI消化したものを用いた。次いで平滑末端の2本鎖cDNAを調製し、その両側に3'突出末端-CACAを有するアダプターをつないだ。本cDNAをMETベクターのBstXIサイト(-TGTG)に挿入後、大腸菌に挿入してcDNAライブラリーを作製した。cDNAライブラリーからランダムにクローンを選択して、プラスミドDNAを抽出後、EcoRIで消化して各クローンのインサートの鎖長をアガロース電気泳動で調べた。またT7プライマーを用いて5側からその塩基配列を決定した。さらにこれらの塩基配列をGenBankおよびESTのデーターとホモロジーサーチを行なった。cDNAライブラリーは当初予想していたよりも長さが短かく、数も数万クローンと少なく2本鎖cDNAのサイズによる分画が必要であることが明らかになった。poly(A)の長さは18個とプライマー本来の長さで、かつ正方向に挿入されたものが半数以上を占めた。プライマー内の終始コドンは残っており、cDNAが逆に挿入された場合でもこれらの終始コドンが有効に働くことが示唆された。またcDNAを方向性をつけて挿入することは意味のあるクローンの数を増やすためにも必要であることが示された。今回塩基配列を決定したクローンの内6クローンがESTにヒットした。全く未知のものが3クローンあった。このことは本格的にcDNAライブラリーをスクリーニングするときに新しい膜結合蛋白の発現を期待させる結果である。