セルソーターを用いる微生物の属・種、機能に特異的な効率的スクリーニング法の開発

• Project/Area Number: 08650944
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: 生物・生体工学
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 桂樹 徹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (80081579)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 信行 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (10273848) ; 谷 吉樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 副学長 (60026424)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000); Fiscal Year 1996: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
• Keywords: スクリーニング / サイトメトリー / セルソーター / チアミン / ゲルマイクロドロップ

Research Abstract

[目的]微生物のスクリーニングでは土壌などのサンプルから目的の微生物を集積、選択培養してから、適当な方法によってコロニーなどの形で単離するが、培養に時間がかかり、また効率的でもない。そこで、細胞を効率良く検出、分離できるセルソーターの技術(フローサイトメトリー)を利用することを企画した。実験モデルとして、チアミンを著量生成するパン酵母の改良、大腸菌の特定の菌株の検出、を採り上げる。
[方法と結果、総括]酵母では、酵母菌体をそのままアルカリ条件下、赤血塩と反応させ、菌体内のチアミンを蛍光物質チオクロームに導き、これをプローブとして個々の細胞をサイトメトリー解析した。しかし、大多数の細胞が死んだ。酵母を生かして得るためにゲルマイクロドロップ(GMD)法により一旦マイクロクローンにすることにした。すなわち、細胞を融解寒天に懸濁し、W/O型エマルションにしてから固化させてGMDとし、短時間の培養を行なった。このクローンをGMDのままで反応させてチオクロームを生成させた。マイクロクローン化の条件、反応条件を検討したが、今のところGMDの中の細胞の生存率、チオクロームの生成率はともに不安定である。
大腸菌では、K-1株を認識する市販のマウス抗体IgMを利用し、市販の蛍光標識ラット抗マウスIgM抗体を二次抗体とする方法によった。この蛍光抗体を大腸菌のK-1株、K-12株、C600株との混合懸濁液に反応させ、この方法によりK-1株のみを分離し得た。別のグループが大腸菌O-157:H7株をそれに対する市販の蛍光(一次)抗体を利用してフローサイトメトリーにより検出したと報告したが、今回得た結果はその方法よりは煩雑であったが、任意のプローブを作成して利用できる長所を実証した。