X線構造解析に基づくサイクロデキストリン合成酵素の環形成反応の解析と応用

Research Project

Project/Area Number	08660088
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Research Field	応用微生物学・応用生物化学
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	山根國男筑波大学, 生物科学系, 教授 (20013336)
Project Period (FY)	1996
Project Status	Completed (Fiscal Year 1996)
Budget Amount *help	¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000) Fiscal Year 1996: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Keywords	サイクロデキストリン合成酵素 / X線構造解析 / 蛋白質工学 / 変異酵素 / 環形成反応
Research Abstract	好アルカリ性Bacillus sp.♯1011のサイクロデキストリン合成酵素(CGTase)の遺伝子をクローン化し、大腸菌に導入し、発現させた後、精製・結晶化し、1。8Aの解像度での立体構造解析に成功した。そこで本酵素の活性中心を形成しているアミノ酸残基、アミラーゼと共通するアミノ酸残基などを遺伝子工学的手法で別のアミノ酸に置換した変異CGTaseを構築し、結晶を作成し、解析した。いずれの酵素の場合も1格子当り2分子のCGTaseが含まれていた。また阻害剤アカボ-ス、基質マルトースなどとCo-crystallizationさせることにも成功した。サブタイトS-2' を形成するPhe183とPhe259をそれぞれ同時にLeuに置換したF183L/F259L変異酵素では不均化反応は野性型酵素の93%も保存されているにもかかわらず、β-サイクロデキストリンを精製する環形成反応が0。5%にまで低下していた。またこの変異酵素のアカボ-スによる阻害活性(ID50)は10、000倍も高くなり、アカボ-スの阻害効果はほとんど無くなっていることが分かった。野性型CGTaseとアカボ-スのコンプレックスと変異CGTaseとアカボ-スのコプレックスの立体構造を比較したところ、アカボ-スの結合部位が両者で全く異なっており、変異酵素ではアカボ-スが触媒残基周辺から離れて結合していることが分かった。この結果は3KB-G5CNPを基質にした際の切断点の変化と一致していた。一方この変異酵素によって生成されるサイクロデキストリンは野性型酵素と同様にβ型が主生産物であった。