PHドメインを含むGタンパク質共役型受容体キナーゼの機能解析

• Project/Area Number: 08670140
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: General medical chemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 東原 和成 東京大学, 医学部, 助手 (00280925)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 1996: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
• Keywords: 受容体キナーゼ / PHドメイン / リン脂質 / Gタンパク質

Research Abstract

本研究では、Gタンパク質共役型受容体キナーゼ(βARK)のPHドメインを介した膜移行の生理的意義を分子レベルで解析するため、PHドメイン内の部位特異的変異株を作り、PHドメインリガンドであるGBγとPIP2のβARK活性に対するin vivoでの必要性を調べた。すなわち、βARKはPHドメインを介してPIP2とGβγに結合することがin vitroの系では示されているが、これらの相互作用が生理的に意味があるかは不明である。そこで、上記のin vitroでのPHドメインの機能を失ったβARK変異体が、培養細胞内in vivoでも機能を失うかを検索した。すでに報告ずみのPHドメインのfusion蛋白質での解析結果をもとに、PHドメイン内のアミノ酸を部位特異的に変異させたβARKの発現ベクターを作製した。エピトープタグをつけたムスカリン受容体とアドレナリン受容体を用い、細胞を[^<32>P]リン酸とアゴニストの有無で保温し、受容体を可溶化後エピトープに対する抗体を用いて沈降させ受容体のリン酸化を調べた。Gβγへの結合に重要な部位を変異させたβARKは、アゴニスト依存性のレセプターのリン酸化能力を失ったが、PIP2の結合部位の変異はなんらin vivoでの影響を認められなかった。そこで、私は、PIP2以外のリン脂質の関わりを推定し、PS(phosphatidylserine)の効果をin vitroで調べたところ、Gβγの存在下でPSはβARKの膜移行を促進した。このことは、PIP2のPHドメインへの結合による膜移行は唯一の機構ではないことを示している。以上の結果より、PHドメインにGβγが結合することはβARKの活性化に不可欠で、PIP2やPSといったリン脂質が関わっていることが示唆された。