ビタミンD受容体の遺伝子転写制御活性を有する部位の検討

Research Project

Project/Area Number	08670936
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Research Field	Pediatrics
Research Institution	Research Institute, Osaka Medical Center for Maternal and Child Health
Principal Investigator	中島滋郎大阪府立母子保健総合医療センター, 研究所・環境影響部門, 研究員 (30270771)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	大薗恵一大阪府立母子保健総合医療センター研究所, 環境影響部門, 研究員 (20270770)
Project Period (FY)	1996
Project Status	Completed (Fiscal Year 1996)
Budget Amount *help	¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 1996: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Keywords	ビタミンD / ビタミンD受容体 / 核内受容体 / 遺伝子転写
Research Abstract	1.ヒトビタミンD受容体(VDR)発現ベクターに、PCR法を用いて417番のLeuをAlaに420番のGluをGlnに(L417A-E420Q)それぞれ置換するように変異を導入し、この変異VDRを介したリガンド依存性転写活性促進能をラットオステオカルシンのビタミンD応答領域あるいはdirect repeat(DR3)を含むレポーター遺伝子を用いてCOS-7細胞およびHeLa細胞において検討した。1,25(OH)_2D_3による転写活性促進能はL417A-E420Qで消失した。また、正常VDR(wt)と変異VDRの同時発現実験において、L417A-E420Qはwtの転写活性促進効果に対して弱い抑制効果を示し、さらに変異VDRの79番のCysをSerに置換すると抑制効果は消失した。以上の結果から、ヒトVDRにおいても417番のLeuと420番のGluあるいはその周辺のアミノ酸がリガンド依存性転写活性調節に重要であること(AF-2部位)、AF-2欠失変異VDRのwtの転写活性促進に対する干渉効果は変異受容体のDNA結合を介することが明らかとなった。 2.ウサギ赤芽球ライセ-トを用いたin vitro translation法によりwtおよびAF-2変異VDRを発現させた。これらのwtおよび変異VDRを、大腸菌で大量発現させたN末端に6個のヒスチジンのついたヒトTFIIB(基本転写因子)とin vitroで反応させ、NiNTA agaroseを用いてTFIIBと結合した蛋白を回収し、抗VDR抗体を用いたWestern blot法により解析した。その結果、TFIIBはAF-2欠失VDRとも結合することが明らかとなった。このことから、VDRのAF-2部位にはTFIIB以外の基本転写因子あるいは転写調節因子が関与するものと考えられる。