カンキツウイロイドの遺伝子診断法に関する研究

• Project/Area Number: 08760037
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 植物保護
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 畑谷 達児 北海道大学, 農学部, 助手 (20241367)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: カンキツ / ウイロイド / 遺伝子診断 / カンキツウイロイド / ハイブリダイゼーション / RT-PCR / NASBA / cRNAプローブ

Research Abstract

本研究は、現在我が国のカンキツ産地において、汚染が広がっているカンキツウイロイドの簡易迅速な高感度遺伝子診断法の確立を目的に行った。
1.海外で報告されているカンキツに感染する5種のウイロイドが全て本邦産カンキツに感染していることを明らかにし、それら全てのcDNAクローンを作製した。
2.クローン化cDNAから診断用のDIG標識cRNAプローブを作製し、ドットブロットハイブリダイゼーションによる特異的遺伝子診断を可能とした。
3.更に高感度なRT-PCR法による遺伝子増幅法を検討し、カンキツに含まれる酵素反応を阻害する物質を簡便に除く方法として、検定組織から抽出した核酸をエタノール沈殿させる際に塩酸を加えることが効果的であった。
4.PCR反応系には塩化テトラメチルアンモニウムを加えることにより非特異的増幅を抑えることができた。
5.検定組織からの簡便な核酸抽出法として、検定組織を磨砕せずに、ジチオ炭酸O-エチルカリウムにより細胞壁を溶解して核酸を抽出する方法を確立した。
6.RNA増幅反応であるNASBA法によるウイロイドRNAの増幅を試み、5'-イノシン三リン酸を反応の基質に加えることにより、NASBA法によるウイロイドRNAの増幅法を可能にした。
7.さらにNASBA増幅断片をポリスチレン製マイクロプレートに吸着して、cRNAプローブとハイブリダイゼーションを行い、吸光値測定で判定する、より高感度な新しい遺伝子診断法を開発した。
以上、検定困難な低濃度のカンキツウイロイドを検出、同定する高感度で特異性の高い遺伝子診断を可能にした。