キラー細胞類の自己防御能に関する研究

• Project/Area Number: 08760095
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 応用微生物学・応用生物化学
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 江藤 望 宮崎大学, 農学部, 講師 (90232959)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: パ-フォリン / L-プロテクチン / 自己防御能

Research Abstract

本研究の最終的な目的は、キラー細胞類が標的細胞を攻撃する際、その顆粒内より放出されるパ-フォリンに対し、自己防御のためにキラー細胞類が保有していると考えられている仮想タンパク質Lプロテクチンの存在を明らかにすることにある。今年度の目標は、Lプロテクチンに対するモノクローナル抗体あるいはパ-フォリンをリガンドとするアフィニティーカラムを作製することであった。以下、現時点での成果を順を追って概説する。1、株化されたキラー細胞株CTLL-R8細胞(R8)の二種類の変異株をクローニングすることに成功した。一方は、パ-フォリンの非産生変異株CTLL-R8^-細胞(R8^-)であり、他方は、パ-フォリンの高産生変異株(CTLL-R8.6細胞(R8.6)である。2、R8^-は、パ-フォリンに対する自己防御能を有しており、キラー細胞の対パ-フォリン防御能は、キラー細胞自身が有するパ-フォリンとは、なんら関係ないことが明らかにされた。この結果は、パ-フォリン遺伝子欠損マウス由来LAK細胞を用いた前年度の研究結果(J.Immunol,1995,155,602-608)と一致するものであった。3、R8.6を用いることにより、当初予定していたR8を原料にするよりも、遙かに効率よくパ-フォリンを精製することが出来た。しかし、パ-フォリンをリガンドとしたアフィニティーカラムを作製するには不十分であった。4、そこで、既にクローニング済みのパ-フォリンcDNAをGST融合タンパク法によりコンビナントパ-フォリンを得ることに成功した。しかし、活性は全く保持されておらず、タンパク質の巻き戻しを試みる必要が考えられた。5、一方、Lプロテクチンは、キラー細胞表面に発現していると考えられたので、R8^-全体を抗原とし、抗体の取得を試みた。免疫マウスの抗血清をウエスタンブロッティングにより確認した結果、リファレンスとして使用したパ-フォリンに対して感受性の高いマウス肥満細胞株P815細胞のライゼ-トには認められないバンドがR8^-のライゼ-トに特有のバンドとして検出された。そこでマウス型モノクローナル抗体の作製を試みたが、現在のところ取得するに至っていない。6、免疫動物種をヒトに変更し、IL2,IL4,ムラミルペプチドの存在下で体外免疫を行った。この実験は現在進行中である。