プロトポルフィリノーゲン酸化酵素の分子調節機構に関する研究

• Project/Area Number: 08760315
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied molecular and cellular biology
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 蔡 晃植 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (00263442)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: アミノ酸配列 / クロロフィル / プロトポルフィリノーゲン酸化酵素 / FAD / クロマトグラフィー / 除草剤 / 精製

Research Abstract

ジフェニルエーテル系のアシフルオルフェンやフタルイミド系のS23142は光存在下、非常に低薬量で植物の白化を誘導する。さらに、これら化合物はクロロフィル生合成系のプロトポルフィリノーゲン酸化酵素(Protox)を特異的に阻害する。この阻害剤による白化機構とProtoxの分子調節機構を明らかにするため、まず、いまだ構造が明らかとなっていない葉緑体Protoxの単離・精製を試みた。Protoxの精製を行うにあたり、まずProtoxの局在性及び粗酵素抽出液での酵素学的特性の解析を行った。その結果、Protoxは内在性の膜タンパク質であり、TritonX-100などの非イオン性界面活性剤で可溶化されること、至適pHは7.5から8.0の間であり、Km値は2.8μMであることなどが明らかとなった。葉緑体を比較的簡単にかつ大量に得ることが出来るホウレンソウを出発材料として葉緑体Protoxの精製を試みた。ホウレンソウ葉緑体(約15kg)から葉緑体膜を調製し、TritonX-100で膜を可溶化した後、6段階のクロマトグラフィーにより電気泳動上で単一なバンドとして確認できるまで精製することに成功した(精製度約3000倍)。ホウレンソウ葉緑体Protoxは分子量約60,000の単量体であり補酵素としてFADをもつこと、S-23142により強く阻害される(IC_<50>=10^ηM)ことが明らかとなった。また、葉緑体Protoxにはアイソザイムが存在しないことも同時に明らかになった。精製した葉緑体ProtoxのN末端アミノ酸配列分析を行ったところ、l5残基の配列が得られた。この配列は酵母およびシロイヌナズナのミトコンドリア型ProtoxのN末端領域と相同性が認められた。