HIVプロウィルス転写活性制御におけるAP-1の役割

• Project/Area Number: 08770222
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Virology
• Research Institution: Kitasato Institute
• Principal Investigator: 渡辺 賢治 (社)北里研究所, 東洋医学総合研究所, 研究員 (70191757)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: HIV-1 / LTR / AP-1 / NF-κB

Research Abstract

HIVプロウイルスの転写活性制御に関わるAP-1の役割を具体的に検討し、さらに従来知られているNF-κBとどのような関連があるのかについて検討を加えるために以下の実験を行なった。
1.細胞培養およびHIV1-LTRの転写活性の測定 細胞としてヒトプロモノサイトのU937とT細胞クローンのJurkat細胞を用いた。HIV-1のプロモーターであるLTRとレポーター遺伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)発現遺伝子を連結したプラスミド(pHIV1-CAT)をエレクトロポレーションにてトランスフェクトした後、PMAで刺激するとHIV1-LTRの転写活性が促進される。ゲルシフトアッセイにてNF-κBおよびAP-1の活性化をみると高濃度のPMAではNF-κBが活性化されるが、4ng/ml以下のPMAではNF-κBの活性化はみられず、AP-1のみが活性化されていた。2.HIV-1 LTRの転写活性に与えるAP-1とNF-κBの役割についての検討 AP-1を細胞内で過剰に発現させ、それがHIV-1 LTRの転写活性にどのような影響を与えるかを検討した。このためにはNF-κBの構成因子であるp65とp50の発現ベクターおよびAP-1の構成因子であるc-Jun,c-Fosの発現ベクターをpHIV1-CATとともにトランスフェクトして24時間後に細胞内蛋白を回収し、CAT蛋白の発現をCAT ELISAにて測定した。NF-κB(p65とp50)のトランスフェクションではHIV-1 LTRが活性化されるが、AP-1(c-Junとc-Fos)のトランスフェクションではHIV-1 LTRは活性化されなかった。NF-κB,AP-1を同時にトランスフェクトすると、AP-1はNF-κBのHIV-1 LTRが活性化を抑制した。内因性のAP-1の影響を完全に消去するためにc-Junの転写活性ドメインの欠如したJun dominant negativeを用いた。このJun dominant negativeは過剰に発現されると正常なc-Junが働けなくなる。このJun dominant negativeを加えるとAP-1のNF-κB抑制効果は消失した。