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SELEX法を用いた抗C型肝炎ウイルスアプタマ-のスクリーニング

Research Project

Project/Area Number 08770223
Research Category

Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Virology
Research InstitutionLouis Pasteur Center For Medical Research

Principal Investigator

吉本 美和  (財)ルイ・パストゥール医学研究センター, 基礎研究部, 研究員 (90280677)

Project Period (FY) 1996
Project Status Completed (Fiscal Year 1996)
Budget Amount *help
¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 1996: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
KeywordsSELEX / RNA aptamer / in vitro evolution / RNA polymerase / HCV / NS5
Research Abstract

HCVゲノムNS5b領域の産物はRNA依存RNAポリメラーゼ(RdRp)活性を有する。このRdRpはHCVの複製に必須であり、その遺伝子配列は比較的よく保存されている。一方、核酸を対象とした進化実験系の代表的なものとしてSELEX法が挙げられる。この場合対象となるのはtRNA様分子であり、RNA製剤のリ-ド化合物のスクリーニングに応用できる。本研究では、バキュロウイルスの系で発現させたRdRpをターゲットとしたSELEX法を行い、RNAアプタマ-のスクリーニングを試みた。
まず20〜30merのオリゴヌクレオチドを合成し、その内Random変異を導入した断片を挟む形で3種の断片をLigationでつなぐ。それを鋳型DNAとしてT7 RNA polymeraseによりRNAの転写を行い、得られたtRNA様分子集団を出発世代のRNA poolとして用いる。次に精製したRNA分子とNS5抗原をincubationし、ニトロセルロース膜上でRNA-Proteinのハイブリッドを形成させ、NS5抗原と結合性を示すRNA分子を得る。その後、選択された微量のRNAを鋳型として逆転写反応によりcDNAを合成し、PCRで増幅する。こうして得られたDNA poolを用いて、T7 RNA polymeraseによる転写とDNase処理を行った結果、再びRNAの分子集団を得ることができる。以上をSELEX法の1Cycleとし、以降同様の操作を繰り返した。現在はSELEX法と並行してDNA poolの塩基配列の多様性をPCR-SSCPにより見積もっており、その配列が限定された時点でSELEX法の反応Cycleは停止させる予定である。得られたRNAはRT-PCRにより増幅後クローニングし、塩基配列を決定する。

Report

(1 results)
  • 1996 Annual Research Report

URL: 

Published: 1996-04-01   Modified: 2016-04-21  

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