心筋アデニリルサイクレースの活性調節と転写調節

• Project/Area Number: 08770532
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Circulatory organs internal medicine
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 岩見 元照 久留米大学, 医学部, 助手 (90203405)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 1996: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: アデニル酸サイクレース / プロテインカイネースA / リン酸化 / 活性調節

Research Abstract

主として心筋と脳に多く発現するアデニル酸サイクレースV型(以下ACV)のプロテインカイネースA(以下PKA)による活性調節を検討するため以下の実験を行った。(AC Vの精製)AC VのcDNAをベクターを用いてバキュロウイルスのDNAにhomologous recombinationし、H5細胞に感染させて大量にAC Vを産生させた。その後、カラムを用いてAC Vを精製した。標品の確認はACV抗体によるウエスタンブロッティングと銀染色により行った。(ACVのPKAによる活性調節)精製されたAC Vを無刺激のものと促進性GTP結合蛋白質(以下Gsα)あるいはフォルスコリンで刺激するものに分け、刺激後PKAによってリン酸化した。PKA阻害剤を加えた後、Salomonらの方法によりAC活性を測定した。AC活性はPKA濃度依存性に最大40%の有意な活性低下を示した。この抑制効果はPKA阻害剤により完全に消失した。次に、PKAによるACリン酸化のtime courseと精製ACの活性変化の関係を見たところ、リン酸化2分後より有意に活性低下を認めた。(AC Vのkinetic analysis)PKAによるACリン酸化はVmaxを低下させたが、ATPに対する親和性(Km)は変化させなかった。(AC Vのphosphopeptide mapping)AC VをPKAあるいはPKCαによりリン酸化(^<32>Pによる標識)した後、トリプシンにより消化し、acidic PAGE上に展開、X線写真上に感光させた。それぞれのリン酸化パターンは異なり、AC VのPKAとPKCαのリン酸化部位が異なることが推測された。現在、心筋細胞内で同様のPKAによるAC活性調節が起こっているか実験中である。また、同時にACVの転写調節についてもRT-PCRを用いて実験中である。