ヒト・リコンビナント・リンフォトキシンβの作製とモノクローナル抗体株の確立

• Project/Area Number: 08770929
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: General surgery
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 中田 達広 愛媛大学, 医学部・附属病院, 助手 (40260690)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: リンフォトキシンβ / リコンビナント蛋白 / pETベクター / 抗リンフォトキシンβ抗体

Research Abstract

健常人末梢血からリンパ球を分離しリコンビナント・インターロイキン2(IL-2)を添加培養し、LAK細胞を作製した。LAK細胞からmRNAを抽出し、さらにcDNAを合成した。そのcDNAをテンプレートとして、この実験のためにデータベースから設計したプライマーを用いて、PCR法によりリンフォトキシンβ(LT-β)のcDNAを増幅した。得られたLT-βのcDNAを制限酵素にて処理したのち、スピンカラムで処理し同制限酵素で処理したpET29b(+)ベクターにライゲーションさせた。得られたベクターにて大腸菌株JM109をトランスフォーメーションさせ、純粋なLT-βのcDNAインサートを有するベクターを精製した。そのベクターを用いて蛋白発現用大腸菌株BL21(DE3)をトランスフォーメーションさせた。同菌株をプレートに培養しコロニーを得た後、PCR法にてインサートの有無をスクリーニングし数種の株を得た。それらの株を培養後IPTGにて蛋白発現を誘導させ、SDS-PAGE法にて電気泳動し、PVDF膜に電気的に転写させた後、ベクターの有する蛋白産物特異的シーケンスを利用した染色を行い最終的に1株を得た。その大腸菌株を大量培養しIPTGで蛋白発現を誘導させた後、菌体を遠心した。誘導蛋白は封入体中に含有されていたため、菌体を尿素とグアニジウムにて可溶化させた後、カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、純粋なヒト・リコンビナントLT-β蛋白を大量に得た。得られた蛋白を家兎に免疫し、ポリクローナル抗体を作製した。また、同蛋白をマウスに免疫し常法にてモノクローナル抗体の作製を試みているが現在までのところその作製には成功していない。今後もモノクローナル抗体の作製を引き続き行うとともに、得られたLT-β蛋白と抗LT-β家兎ポリクローナル抗体を用いてLAK細胞の抗腫瘍活性の解析や、その他細胞でのLT-β発現の検討を行う。