ラット網膜培養系における神経細胞の分化の研究

• Project/Area Number: 08771521
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Ophthalmology
• Research Institution: Kyorin University
• Principal Investigator: 朝蔭 博司 杏林大学, 医学部, 助手 (00281345)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: HPC-1 / syntaxin / 網膜細胞培養

Research Abstract

HPC-1/syntaxin 1Aは、ラット海馬細胞膜特異抗原として赤川らにより報告されたC末端に膜貫通部位を有する分子量35kDの膜蛋白質で、シナプス前膜におけるexocytosisへの関与が注目されている。一方、単層培養系ではすでに神経細胞発芽を抑制的にコントロールすることが示唆されている。本研究において、出生直後のWistarラットの網膜細胞を再凝集培養し、その組織を光顕像および免疫組織染色により確認した。また、培養過程におけるHPC-1の発現量をWestern blot法により検討した。1,実験方法:(1)細胞培養:出生24時間以内のWistarラットより網膜のみを単離し、Ca Mg free HANKS液内で網膜細胞を分離させインキュベータ-内で再凝集培養した。(2)組織検索:細胞塊はエポン包埋し切片を作成した。切片はトルイジンブルー染色し光顕で観察した。また、他の再凝集培養塊は4%PFAで固定した後、クライオスタットで凍結切片を作成した。一次抗体として、ポリクローンHPC-1抗体およびモノクローンチュブリン抗体を各切片に反応させた後それそぜに、二次抗体としてロ-ダミンでラベルした抗ウサギIgG抗体およびFITCでラベルした抗マウスIgG抗体を反応させ、蛍光顕微鏡下で観察した。(3)Western blot法によるHPC-1発現量:培養1日目および7日目の培養細胞をBuffer(1%NP-40 1mM EDTA 1mM DTT 0.1mM PMSF/PBS)内で溶解しサンプルを得た。各サンプルのHPC-1の発現をチュブリンをコントロールとし、型のごとくWestern blot法にて確認した。2,結果:トルイジンブルー染色され切片は層構造を呈しており、免疫組織染色でチュブリン抗体は、再凝集細胞塊全体に分布するのに対し、HPC-1抗体は切片の表層に多く分布していることが確認できた。HPC-1発現量は、培養1日目に比べ7日目のサンプルで増加していることが確認できた。