骨芽細胞における24-水酸化酵素遺伝子のStable transfection

Research Project

Project/Area Number	08771658
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	病態科学系歯学(含放射線系歯学)
Research Institution	Ohu University
Principal Investigator	西勝祥子奥羽大学, 歯学部, 助手 (30170484)
Project Period (FY)	1996
Project Status	Completed (Fiscal Year 1996)
Budget Amount *help	¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 1996: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	24-水酸化酵素 / クローニング / 1,25(OH)_2D_3 / COS-7 cell / Transfection / ビタミンD代謝 / シクロヘキシミド
Research Abstract	24-水酸化酵素は、活性型ビタミンDである1α,25-dihydroxyvitamin D_3[1,25(OH)_2D_3]の分解及び循環型ビタミンDである25-hydroxyvitamin D_3(25OHD_3)代謝の主要な酵素である。本酵素は腎や小腸で1,25(OH)_2D_3投与により強く誘導され、1991年にその遺伝子がクローニングされた。代表研究者は、マウス24-水酸化酵素のFull-length cDNAのクローニングに成功し、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド投与により、腎や小腸でそのmRNAが著しく上昇することを見出した(Endocrinology 1997 in press)。また、活性型ビタミンDアナログの22-oxacalcitriolが24-水素化酵素のmRNA及び活性を腎と小腸で増加させ、1,25(OH)_2D_3の分解を促進し、血中1,25(OH)_2D_3レベルを低下させることを見出した(Biochem.Pharmacol.48(11):2081-2090,1994)。 24-水酸化酵素を定常的に発現している細胞株を得るために、今回クローニングしたマウスのFull-length cDNAをLipofectinを用いてCOS-7細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしたCOS-7細胞からtotal RNAを抽出し、24-水酸化酵素mRNAの発現量をマウス24-水酸化酵素cDNAをプローブとしてNorthern blot法で検討した。その結果、このCOS-7細胞は非常に大量の24-水酸化酵素mRNAを発現していることが確認された。しかしながら、トランスフェクトしたCOS-7細胞における24-水酸化酵素の活性は検出されなかった。この理由は不明だが、水酸化酵素活性発現のために必須の電子伝達体としてのフェレドキシンやフェレドキシンリダクターゼの発現がCOS-7細胞中で不十分であることが考えられる。今後、24-水酸化酵素、フェレドキシン、フェレドキシンリダクターゼの3種のcDNAを同時に細胞にトランスフェクトし、定常的に24-水酸化酵素遺伝子及びその酵素活性を発現している細胞株の確立をめざしたい。