物理的刺激が骨芽細胞と破骨細胞に及ぼす影響-情報伝達に関する分子生物学的検討-

• Project/Area Number: 08771966
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 矯正・小児・社会系歯学
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 小牧 憲明 長崎大学, 歯学部附属病院, 助手 (00253675)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 遠心力負荷 / パルス電磁場刺激 / ヒト由来骨芽細胞様細胞 / 細胞内情報伝達経路 / Prostaglandin / 破骨細胞 / 石灰化能 / 骨吸収能

Research Abstract

1)骨芽細胞ならびに破骨細胞の分離・培養:骨芽細胞はヒト正常皮質骨より初代培養法にて採取した。破骨細胞は、1,25(OH)_2D_3を添加してマウス由来骨髄細胞を培養し、形成させた。
2)力学的刺激ならびに電気的刺激の負荷:力学的刺激として、500から1500回転の遠心力を12時間ごとに20分間、また、電気的刺激として、パルス電磁場発生装置を用いて、0から7ガウスのパルス電磁場刺激を連続的に負荷した。
3)細胞内情報伝達経路の検討:各種細胞内情報伝達経路の特異的阻害剤を添加し、物理的刺激に対する反応性の変化を検討した。
4)分子生物学的検討;各種条件下で培養を行った細胞のmRNAを抽出し、ノーザンブロッティング法による解析を行い、各種細胞内情報伝達物質のmRNAを検索した。
5)物理的刺激が骨芽細胞・破骨細胞に及ぼす影響の評価
・骨芽細胞の評価:ALPase活性、BGP産生能を測定し、分化過程を評価した。さらにVon Kossa染色を施し、画像解析装置を用いて石灰化量を定量化した。
・破骨細胞の評価:TRACP染色を行いその形成数を測定し形成能を評価した。さらに破骨細胞をdentine slice上で培養してその吸収窩を染色し、画像解析装置を用いて吸収面積を定量化した。
6)結果ならびに考察:遠心力負荷により、骨芽細胞のALPase活性、BGP産生能は負荷量依存的に上昇したが、石灰化能の顕著な変化は認められなかった。また、破骨細胞形成能と吸収能にも変化は認められなかった。パルス電磁場刺激により、骨芽細胞のALPase活性は刺激強度依存的に上昇したが、BGP産生能は抑制された。骨芽細胞の石灰化能ならびに破骨細胞の形成能と吸収能は、わずかに上昇する傾向が認められた。細胞内情報伝達経路の検討のため、骨芽細胞培養系にindomethacinを添加すると、添加濃度依存的に物理的刺激に対する反応性は減少した。また、Calphostin Cを添加してもその反応性の変化は認められなかった。以上の結果から、物理的刺激は、骨芽細胞の分化を促進すること、この反応にprostaglandin産生が関与しており、protein kinase Cは関与していないことが示唆された。ノーザンブロッティング法による解析の結果、prostaglandin産生に関与するmRNAのわずかな増加が認められた。破骨細胞培養系に顕著な変化は認められなかったが、prostaglandin産生が関与していたことから、骨芽細胞を介して刺激に応答している可能性が示唆された。
また、両刺激により骨芽細胞が異る反応性を示したことから、反応経路が異る可能性も示唆された。今後、両刺激に対する反応経路の違いや、細胞内情報伝達物質についてさらに詳細な検討を加えて行く予定である。