ビタミンD_3活性化酵素の精製と性質の解明

Research Project

Project/Area Number	08780590
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Functional biochemistry
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	大山義彦広島大学, 理学部, 助教授 (30169081)
Project Period (FY)	1996
Project Status	Completed (Fiscal Year 1996)
Budget Amount *help	¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 1996: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	ビタミンD_3 / 25-ヒドロキシビタミンD_3 / 1,25-ジヒドロキシビタミンD_3 / 25ヒドロキシビタミンD_3 1α-水酸化酵素 / チトクロムP450 / 酵素精製 / カルシウム代謝 / 骨形成
Research Abstract	1α,25-ジヒドロキシビタミンD_3(1,25(OH)_2D_3は,小腸でのカルシウム吸収,骨からのカルシウムの動員など生体内でのカルシウム濃度の維持に関与するホルモンである。これまでに1,25(OH)_2D_3は,腎臓ミトコンドリアに存在するチトクロムP450によって25(OH)D_3の1α位が水酸化され生成することが知られている。しかし,未だこの1α-水酸化酵素の精製はなされていない。本研究では以下の手順で1α-水酸化酵素の精製を行った。孵化直後からビタミンD欠損食で3週間飼育したニワトリの腎臓を材料とした。まず,ミトコンドリアをコール酸により可溶化した。この超遠心上清を自作したペンチルセファロースカラム(疎水ゲル)にかけ0.3%エマルゲンで溶出した。つぎにヒドロキシアパタイトカラムを通した。活性は非吸着画分に回収された。これをCM-セファロースカラムで濃縮した後,PorosCMカラムを用いたHPLCにてリン酸緩衝液のグラジエントにより溶出した。これらのカラムクロマトグラフィーでは417nmでヘム蛋白質の溶出をモニターし,ヘムタンパク質を含む画分について25(OH)D_3を基質とし,アドレノドキシン,アドレノドキシンレダクダーゼを加えて水酸化反応を再構成し,1,25(OH)_2D_3の生成量をHPLCにて定量した。最終標品の比活性は10nmol product/min/mg proteinでありミトコンドリアの可溶化上清の2000倍であった。また,P450の比含量は1.3nmol P450/mg proteinであった。以上の方法で,これまでに報告されたものより高い比活性をもつ画分が得られたが,SDSポリアクリルアミド電気泳動では分子量56000付近に2本のバンドが認められた。今後さらにカラム条件を検討するとともに抗体作成を行う予定である。