進化分子工学を用いたアミノ基転移酵素の基質特異性の変換

• Project/Area Number: 08780601
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Functional biochemistry
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 矢野 貴人 大阪医科大学, 医学部, 講師 (40239827)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 進化分子工学 / 人工進化 / タンパク質工学 / アミノ基転移酵素 / アミノトランスフェラーゼ / 構造機能相関

Research Abstract

1.進化分子工学を用いて、D-アミノ酸アミノ基転移酵素の基質特異性を分枝鎖L-アミノ酸に変換するために、信頼性の高いスクリーニングの系を確立した。
(1)分枝鎖L-アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子(ilvE)欠損大腸菌株の作製:相同組換えによるknock out法により、大腸菌染色体上のilvE遺伝子のN-末端側から90%をカナマイシン耐性遺伝子に置き換えた菌株を作製した。この菌株は、分枝鎖アミノ酸に対して予想通りの栄養要求性を示した。
(2)変異遺伝子ライブラリー発現のためのベクターの作製:タンパク発現量の異なる種々のベクターを作製した。これを、スクリーニングの各ステップで適宜用いる。
(3)栄養要求性選択培地の条件を確立した。
2.同じ目的の研究対象としてL-アスパラギン酸アミノ基転移酵素を新たに加え、そのための発現ベクターを作製した。スクリーニングのための菌株、選択培地の条件は上と同じものを用いる。
3.上記の系を用いて、スクリーニングを行っている。