真核生物のヘム依存性転写因子の研究

• Project/Area Number: 08780605
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Functional biochemistry
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 中村 寛夫 理化学研究所, 生体物理化学研究室, 研究員 (80270594)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1996: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: ヘム / 転写因子 / 酸素適応 / ヘム結合モチーフ

Research Abstract

真核細胞のモデル生物である出芽酵母には環境の酸素濃度の変化に共役して呼吸系および酸素代謝系酵素群の生合成量が変動する、という適応現象がある。これらの遺伝子発現を制御するHAP1遺伝子産物は、細胞内ヘム濃度に依存し活性化する転写因子である。本研究ではHAP1蛋白質におけるヘムの結合様式とエンハンサー結合能の制御機構の理解をめざし本蛋白質の発現系の構築をおこなった。
まず、DNA結合領域とヘム結合領域をふくむN末端側446個までのポリペプチドをコードする遺伝子を6xHisタグに融合させ大腸菌で発現させたところほとんどが不溶性であり、可溶性画分には分解産物があることが判明した。また、シャペロニン、チオレドキシンとの共発現でも可溶性画分での発現効率は向上しなかった。チオレドキシンなどとの融合蛋白質を作製してもやはり不溶性となった。
本蛋白質の不溶性は異種蛋白質との融合の長さに起因すると考えられる。そこで43残基からなる短いカルモジュリン結合ペプチドをC末端に融合し、完全長の蛋白質を特異的に検出できる組換えプラスミドを用いてプロテアーゼを欠損した大腸菌内で発現させる系を構築した。その結果、遺伝子発現を誘導し1時間後から可溶性画分に完全長のHAPl蛋白質の生成が確認された。今後は陽イオン交換カラム、アフィニティーカラムを用い精製条件の検索をおこなう。さらに、精製標品とヘムの結合を分光学的測定によって明らかにし、エンハンサーとの結合能との相関を解析する。