| Project/Area Number |
08780701
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Developmental biology
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| Research Institution | Ochanomizu University |
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Principal Investigator |
清本 正人 お茶の水女子大学, 理学部, 講師 (70251692)
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| Project Period (FY) |
1996
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1996)
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| Budget Amount *help |
¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | 骨片形成 / 小割球 / ウニ / バイオミネラリゼイション / 細胞分化 |
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| Research Abstract |
ウニ胚の骨片形成に必要な因子を精製するために、間充織胞胚をCa・Mg欠如海水で洗い、1Mグリシン中で胚細胞を解離し、その遠心上清を8M尿素中で透析して可溶化した後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。しかし、試料をカラムに添加する最に圧力が上昇し流速が低下する問題が生じた。また、活性因子の溶出に必要な塩濃度は緩衝液中の尿素濃度により異なるので、最適な条件を検討した。まずバッジ法にて8M尿素を含む緩衝液中で50mMNaClの塩濃度で因子をゲルに保持させ、250mMの塩濃度で因子を回収した。次のカラムクロマトグラフィーでは、4M尿素を含む緩衝液を用い、50mMの塩濃度で試料をカラムに添加し、500mMへ直接的に塩濃度を上げ分画した。ほとんどの蛋白は低濃度の塩で溶出してきた。各分画を海水で希釈し検定した場合、蛋白量の多い分画に骨片形成誘導因子の活性があった。しかし、各分画を0.5%の低濃度の馬血清を含む海水で希釈し検定したところ、高濃度の塩で溶出される分画にも高い活性が認められた。この分画の成分は10μg/ml 以下の濃度でも効果があった。SDSポリアクリルアミド電気泳動では、この分画には特に分子量100kD以上の成分が顕著であった。
単離小割球の培養による生物検定で、低濃度の血清に替る有効な成分を探すため、これまで小割球-第一次間充織系の細胞に対して各々遊走や仮足形成の効果が報告されているフィブロネクチンとインシュリン、また骨片形成への関与が報告されているコラーゲン(typeI,IV)について調べた。低濃度の血清の替りに各々の物質を加えた海水でウニ胚由来の骨片形成因子を希釈し、生物検定での効果を調べたところ、馬血清に匹敵する効果を示すものはなかった。今後、既知の他の物質や精製過程で因子と分画された物質を探究していく必要がある。
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